[发明专利]一种富集分离内源核受体的方法及其专用DNA结合序列

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中目的蛋白的富集分离方法，特别是涉及一种富集分离内源核受体的方法及其专用DNA结合序列。

背景技术

核受体(nuclear receptor，NR)是动物体内最大的转录因子家族，在生物体内广泛分布，通过与相应配体结合调控特定基因的表达，从而在机体的生长发育、新陈代谢、细胞分化及体内许多生理过程中发挥重要作用。据报道，人、小鼠、大鼠体内表达的NR分别是48、49和47个。结合并活化NRs的配体包括亲脂性底物，如内源激素、维生素A、维生素D和异型生物质、内分泌阻断剂等。由于NR调控大量与疾病相关的基因，包括高血压、癌症、糖尿病、心血管疾病、胆固醇胆石病以及代谢综合症等，因此，NRs也是很重要的药靶，目前，FDA批准的药物有13％以上针对NR。

NR对靶基因的转录调控乃至其在各种生理病理等生物学过程中的重要作用主要依赖于其蛋白水平的微妙变化及精细调控。因此，在蛋白水平上开展NR的研究显得非常迫切，但NR在细胞内的表达丰度极低，而且受多种翻译后修饰和辅调节蛋白的调控，使得对内源性NR及其形成的复合物的分离鉴定非常困难；采用特异性抗体进行亲和纯化看似很有效，然而，一方面抗体成本太高，另一方面，目前仅少量的NR及其辅调节蛋白存在抗体，这大大限制了抗体亲和纯化方法的应用。为此，迫切需要发展新的技术方法对NR及其复合物进行分离纯化、鉴定、重构，以及对其各个组分进行功能解析。因此，急需开发一种高效、广谱的NR亲合纯化试剂，使从组织样品中分离纯化内源NR超家族及其辅调节蛋白成为可能，为鉴定NR表达谱、寻找NR的配体或辅调节蛋白，以及后续的功能研究奠定基础。

在分子水平上，核受体通过其保守DNA结合结构域与DNA反应元件结合，调节下游靶基因的表达。与核受体结合的DNA反应元件统称激素反应元件(hormone response element，HRE)，在NR识别的所有HRE中，都含有一个由6个保守核苷酸对组成的核心识别模块，即AGGTCA，该序列也叫“半位点”。HRE中“半位点”的不同排列方式以及“半位点”间核苷酸对的不同长度对核受体识别不同HRE的特异性起关键作用，这也决定了NR对靶基因的选择特异性。根据NR识别的HRE的结构特点，可以将NR分成3类：第一类是识别含单一“半位点”HRE的NR，主要包括那些以单体形式发挥作用的NR，如NGFI-B、RevErb、ROR和SF-1等；第二类NR识别的HRE含两个顺式串联排列(direct repeat，DR)的“半位点”，所有直接重复的HRE序列中的两个“半位点”间的距离在1-5个碱基对间变动，这类NR主要包括那些能与RXR形成异二聚体发挥功能的NR，如VDR、LXR等；第三类NR识别的HRE也由两个半位点组成，但这两个半位点以反向重复(invert repeat，IR)的方式排列，其两个“半位点”间的距离也在1-5个碱基对间变动，这类核受体通常以同源二聚体的形式发挥功能，包括ER、AR、GR等。

NR是一种配体活化型转录因子，在机体生长发育、新陈代谢、细胞分化、昼夜节律及许多生理过程中发挥重要作用。但是，内源NR及其辅调节蛋白的检测还面临很大的技术难题，首先，NR及其辅调节蛋白在体内的表达水平很低，用常规的技术手段难以检测到；其次，虽然采用抗体和免疫沉淀策略也能实现内源NR及其辅调节蛋白的分离鉴定，但抗体的成本很高，而且目前可获得的抗体种类非常有限，这就大大限制了内源NR及其辅调节蛋白的分离鉴定。

发明内容

本发明提供了一种富集分离内源核受体的方法及其专用DNA结合序列。

本发明所提供的DNA结合序列，是串联多个单拷贝激素反应元件的DNA序列，每个单拷贝激素反应元件包含两个由不同长度寡核苷酸链间隔的保守半位点，各单拷贝激素反应元件间由3-5bp的接头序列(Linker)串联，各单拷贝激素反应元件均基于序列11所示的基础单元设计，具体如序列表中序列1-17所示，拷贝数为3n(n为正整数)。

其中，该DNA结合序列通过分子克隆技术及体外连接方法获得，拷贝数为3、6、9、12、15或18。

具体的DNA结合序列，所述单拷贝激素反应元件为序列表中序列1所表示的DR1，其串联3、6、9、12、15拷贝的DNA序列如序列表中序列18-22所示；或者所述单拷贝激素反应元件为序列表中序列8表示的IR3，其串联3、6、9、12、15拷贝的DNA序列如序列表中序列23-27所示。