[发明专利]一种多种蛋白共表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的一种用于多种蛋白共表达的载体的构建方法，属生物和医药新技术领域。

背景技术

为实现在同个细胞内表达多种蛋白，常用的手段是质粒共转染技术，但质粒的不相容性常会导致一种质粒的丢失，同时是否能够实现两个质粒在阳性转染率上一致也存在一定的困难。因此如果一个质粒能够表达多种蛋白将会有很大的优势。目前利用一种质粒表达多种蛋白的常用手段为加入IRES(核糖体内部进入位点)序列，对一种以上的蛋白进行表达。目前常用的是EMCV的IRES序列，但是IRES介导的翻译效率不可控，表达不太稳定。利用关于多启动子的报道多是基于串联多个启动子共同调控同一个蛋白的表达，目的是增强外源基因的表达率。本方法的思路在于在同一个质粒中插入多个同样的启动子序列及下游的polyA序列，这样就能保证所需表达的基因在转录水平上处于完全一致的水平。而后续的翻译水平可以通过修饰AUG周围的序列进行更精确的不同基因蛋白表达水平的调控。因此，本方法能够使得同一个载体上实现多种基因共表达，也使得各基因表达产物按照规定的比例进行生成成为可能。通过本方法可以用于实现多种外源蛋白在真核细胞内的按定量的比例进行表达、也可以用于多种蛋白相互作用及示踪定位等研究，具有很大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多种蛋白共表达载体构建的方法，从而可以多种蛋白的共表达。

本发明利用在同一载体中插入多个同一的启动子(如RSV、CMV、SV40、LIR、MMTV-LTR、ALV-LTA等)及下游的polyA序列，这样就能保证所需表达的基因在转录水平上处于完全一致的水平。而后续的翻译水平可以通过修饰AUG周围的序列进行更精确的不同基因蛋白表达水平的调控。以这样的质粒转染到哺乳动物细胞中，多种蛋白将能实现按固定比例的定量表达。

本发明所述的载体构建的方法，主要为在同一载体中插入多个同一的启动子(如RSV、CMV、SV40、LIR、MMTV-LTR、ALV-LTA等)及下游的polyA序列，以保证各种基因在mRNA的水平一致性。

本发明所述方法特征在于，以首先保证各种基因在mRNA的水平一致性，作为多种蛋白共同表达的基点。而后通过对AUG的优化来实现多种基因能够按固定比例进行表达。

本发明的优点是用同一的启动子及下游polyA序列来保证各个基因在转录时处于几乎相同的环境，从而保证各种基因的转录产物mRNA能处于一致的水平。该方法使得多种蛋白的共表达更加精确和稳定，使得多种蛋白按设定比例进行表达成为可能。

附图说明

图1双启动子双报告基因重组表达载体质粒结构简图。

图2重组质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP酶切鉴定。M1：M：Lambda DNA/Hind III Marker；1：pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经XhoI，SalI双酶切后的EGFP条带(720bp)；2：pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经Xbal，MluI双酶切后的DsRed条带(680bp)；3：pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经Spel酶切，在2011bp出现特征性条带，鉴定为顺向连接双启动子M2：DNAMarkerD。

图3、重组质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP转染293T细胞48h后红绿荧光蛋白的表达情况。

图4、Western blot检测红绿荧光蛋白表达情况。1：转染pCI-nEGFP的293T细胞中EGFP的相对表达量；2：转染pCI-nDsRed的293T细胞中DsRed的相对表达量；3：转染pCI-cmvDsRed-cmvEGFP的293T细胞中EGFP的相对表达量；4：转染pCI-cmvDsRed-cmvEGFP的293T细胞中DsRed的相对表达。

实施例1

pCI-cmvDsRed-cmvEGFP双启动子载体的构建

a)pCI-EGFP的构建

以Clontech的EGFPN1为模板，带NheI酶切位点的正向引物EGFP-5′与带NotI酶切位点的反向引物EGFP-3′进行PCR扩增EGFP编码区片段。PCR产物经NheI及NotI双酶切回收之后，插回表达载体pCI的多克隆位点中，获得pCI-EGFP质粒。

b)pCI-DsRed的构建