[发明专利]特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的检测方法，具体涉及一种特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR(聚合酶链式反应)技术。

背景技术

在PCR检测方面，PCR引物特异性很难令人满意，一些文献做PCR或实时荧光PCR没有用相近细菌作对照，只介绍了灵敏度而没有介绍特异性，而瓜类作物上除了果斑病菌还有角斑病菌等其它细菌。有的PCR引物设计很不合理，如某学位论文的PCR引物5’-GACCAGCCACACTGGGAC-3’经BLAST居然出现排在前面的序列没有果斑病菌序列。

另一硕士论文中设计的PCR引物也是如此，用其设计的引物做BLAST，结果前30条序列中没有果斑病菌序列。第34-37条才是此果斑病菌的序列，然而序列覆盖率只有90％，其中相同碱基只有95％。

还有一篇论文中也是在16S rDNA区设计的PCR引物，用正向引物做BLAST，前1万个找到的序列都是100％覆盖和100％碱基相同，而果斑病菌的前5千个序列中没有出现，反向引物BLAST前250条序列都是100％覆盖和100％碱基相同。这些100％覆盖和100％碱基相同的序列有不少是植物内生菌，检测时必然有假阳性出现。

因此，采用以上PCR引物检测果斑病菌时，并不能明显区分出果斑病菌和其他病菌，更不能检测出西瓜上果斑病菌，因此检测技术特异性是一个亟待解决的难题。

本人亦试图依据果斑菌16S序列来设计引物，结果未能成功找到特异性好的备选序列。

发明内容

本发明所要解决技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种特异性检测西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的PCR方法，解决了西瓜上果斑病菌PCR检测上引物特异性不好的问题，可以准确地检测西瓜上带果斑病菌的情况。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR方法，该方法是以西瓜上果斑病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定，该特异性引物为：

正向引物：5’-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3’，

反向引物：5’-ACGGCACCTGACCCGTTG-3’。

详述如下：

一、引物的设计：

发明人利用细菌种间甚至亚种间菌毛蛋白基因核苷酸序列的特异性，从NCBI/GenBank搜索并下载了果斑病菌AAC00-1菌系IV型菌毛蛋白基因(GenBank：CP000512.1全基因组序列上从第3041429个碱基到第3041923个碱基共495个碱基)的核苷酸序列，运用MEGA4.0软件对这些序列进行比对，经BLAST只找到其本身，见图1。

依据此序列用primerBLAST工具设计PCR引物序列如下：

正向引物：5’-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3’(如SEQ ID No：1所示)

反向引物：5’-ACGGCACCTGACCCGTTG-3’(如SEQ ID No：2所示)；

上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR产物预期大小为333个碱基。

将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，见图2和图3。结果表明：该正向引物和反向引物的序列与果斑病菌AAC00-1菌系IV型蛋白基因序列100％相同，而与其它菌的序列最高覆盖率只有88％。

二、病菌的PCR过程：

西瓜上细菌基因组DNA的提取：取西瓜上的果斑细菌在常用的肉汁胨细菌培养基上28℃培养20-30h，得到单菌落，再用无菌牙签挑取单菌落，洗入10μl ddH2O中，99℃处理10min，离心后收集上清液，至于冰上备用。

用上述设计的引物对对果斑细菌总DNA进行扩增，预计扩增片段约为333bp。

PCR扩增体系(25μl)：DNA扩增模板1μl、10×PCR Buffer 2.5μl、dNTPs(10mm)0.5μl、Taq酶(2.5μ/μl)0.5μl、Forward Primer(10mm)1μl、Reverse Primer(10mm)1μl、及dd H₂O 18.5μl。

序列扩增条件：预变性94℃5min；循环参数：94℃30sec；56℃30sec；72℃40sec；共30个循环；72℃10min延伸。

三、PCR扩增产物的鉴定：