[发明专利]饲料样品中肠毒性大肠杆菌的快速测定引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于饲料科学与饲料添加剂检测技术领域，具体涉及一种饲料样品中肠毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli)K88的快速测定引物及其应用。 

背景技术

大肠菌群及其所产生的肠毒素能引起动物和人的食物中毒，最常见的症状是动物和人的腹泻。饲料中大肠菌群的存在，不仅直接危害到畜禽健康，严重时会引起畜禽中毒死亡，造成严重经济损失；致病性大肠杆菌主要有肠毒性大肠杆菌(产肠毒素性大肠杆菌)(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)，肠致病性大肠杆菌(EPEC)，肠出血性大肠杆菌(ELEC)和肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)。其中ETEC是造成新生仔猪和断奶仔猪腹泻的最主要的致病菌之一。ETEC本身具备两个致病因素：一是宿主特异性菌毛(黏附素，黏附因子，定植因子)，通过菌体粘着于小肠的上皮细胞上，以抵抗肠道蠕动和肠内容物的冲刷作用，从而使细菌在定居部位大量繁殖；二是肠毒素，即耐热肠毒素(ST)和不耐热肠毒素(LT)，ST具有抗原性，LT仅有弱抗原性。肠毒性大肠杆菌致病性与其具有粘附性菌毛和产肠毒素密切相关。致仔猪腹泻肠毒素性大肠杆菌粘附性菌毛主要有K88，K99，F41和987P，目前检测肠毒性大肠杆菌菌毛的方法有电子显微镜法、D甘露糖抵抗雪凝试验、细胞粘附试验、基因探针技术和免疫血清学反应等，商品化的快速检测方法主要包括特异性检验的培养基、检测试纸片等，一般是利用大肠杆菌特异性酶检测鉴定大肠杆菌，如可利用Gud酶底物有效检测大肠杆菌。法国科玛嘉CHROM agar Ecoli是目前应用最广泛的大肠杆菌显色培养基，广东环凯公司也开发出了商业化的大肠杆菌显色培养基，这种利用显色培养基检测大肠杆菌的方法虽然成本较低，但得到检测结果需24h-48h，时间较长，且单一方法检测准确性不高，需多种方法复合使用，以提高检测的准确性，缩短检测时间。 

为了有效地控制饲料的产品质量，进一步加强饲料产品及饲料原料的质量监督管理，有必要制定饲料产品中大肠菌群的检测方法及相关饲料产品中大肠菌群允许量。目前，国际标准化组织采用两种大肠菌群检测方法标准来检测食品和饲料中的大肠菌群，一是最大或然数法(Most probable number，MPN)方法(ISO 7251；1993(E))，另一为选择性培养基菌落 计数法。其中应用最广泛的是MPN技术，如英国、美国等均采用此法，但此方法具有检测时间长，易出现假阳性，敏感度低等问题，国内尚未制定饲料中大肠菌群检测方法。 

近年来发展起来的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerasechainreaction，RT-PCR)技术以其特异性强、灵敏度高、速度快等优点在基因表达水平分析、病原体基因的定性和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前细菌快速检测的主要方法。但是，目前，国内还未见报道根据肠毒性大肠杆菌K88菌毛特异基因的SYBR Green I荧光定量PCR方法。 

发明内容

【要解决的技术问题】 

本发明的目的在于提供一种饲料样品中肠毒性大肠杆菌(产肠毒素性大肠杆菌)(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)K88的快速测定引物。该方法避免了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题。本发明的方法不仅具有特异性强、重复性好、准确、快速等优点，且没有假阳性和相互交叉反应的发生，为肠毒性大肠杆菌检测试剂盒的开发奠定基础。 

本发明的另一个目的是提供该引物在定性测定和定量测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌K88中的应用。 

【技术方案】 

本发明的目的是通过下述技术方案实现的： 

本发明提供一种饲料样品中肠毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli)K88的快速测定引物，其特征在于上游引物为：DCf5’-ACAGGTGAAGGTGGAATGG-3’，也如SEQ IDNo.1所示，下游引物DCr5’-TTCCTCTTTCCTCTGCGG-3’，也如SEQ ID No.2所示。 

本发明的引物可用于定性测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌K88。 

其中，定性测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌K88的测定过程如下： 

A.模板DNA的制备