[发明专利]从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是微生物领域中的菌种分离方法，具体的是一种从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法。

背景技术

目前人们可分离培养的微生物只占世界上微生物总量的1%左右，还有99%的微生物目前没有分离得到纯培养菌株。对于好氧菌的纯培养的分离与纯化技术自1880年Koch发明的平板分离法以来已有130多年的历史了，稀释平板涂布法、稀释混合平板法、平板划线法、显微操作器单细胞挑取法都是常规的分离和纯化微生物的方法。前三种方法不需要特殊昂贵的仪器设备，极易操作，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。

对于厌氧微生物的分离与培养有着特殊性，主要是采取各种方法使他们处于没有氧的环境或氧化还原点位低的条件下进行培养。对于厌氧要求相对较低的一般厌氧菌的培养主要有：碱性焦性没食子酸法、庖肉培养基法，这两种方法是最常用的厌氧培养技术，虽然两种方法无需特殊昂贵的设备操作简单，适用于任何可密封的容器，可迅速建立厌氧环境，但其缺点是在氧化过程中会产生少量的有毒气体，会抑制某些厌氧菌的生活，其中庖肉培养基法多应用于厌氧的芽孢菌的分离与保存中。对于严格厌氧菌的分离和培养主要有：Hungate滚管技术、厌氧罐法、厌氧手套操作培养箱，以上方法操作复杂对实验仪器的要求也比较高并且试验成本很高，但也有其自身的优点，就是可以保证环境的绝对厌氧，也不会产生任何有毒的物质而抑制微生物的生长。

纤维素分解复合菌系是一组以高温期堆肥为原料富集获得的具有高效稳定分解纤维素能力的细菌复合群体（一组木质纤维素分解菌复合系的筛选及培养条件对分解活性的影响，王伟东、崔宗均、牛俊玲、朴哲、刘建斌，中国农业大学学报，9（5）：7～11，2004），为了研究其微生物组成，筛选出分解能力更强的菌株，需要将复合菌系进行分离，分离出具有分解纤维素功能的单菌。但是在现有研究中，得到具有分解纤维素功能的单菌比较困难，因为纤维素分解复合菌系中具有分解纤维素功能的菌株通常为厌氧菌，并且在分离的过程中需要随时观察降解纤维素的能力，以上提到的几种厌氧菌分离方法均不适宜。分解纤维素的厌氧菌的分离关键点在于：1、单菌的分离；2、单菌功能的随时检测。目前一般采用Hungate厌氧管技术，Hungate厌氧管能随时观察纤维素降解的情况，但不便进行单菌分离操作，易染菌，因为Hungate厌氧管体比较长，即便产生了单个菌落，菌落在挑出时难度也比较大，容易碰倒其他菌落、挑出时极易与管壁接触，造成挑出的单菌不纯，影响后续实验；而厌氧罐不便随时观察菌种降解纤维素情况。因此，需要发明一种能够适合分解纤维素的厌氧菌的分离方法。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题提供一种从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法，解决目前Hungate厌氧管挑出菌落困难，容易染菌，造成菌落不纯以及厌氧罐法无法随时观察菌种降解纤维素情况的问题。

本发明通过以下技术方案来实现：从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法，包括以下步骤：

A、将纤维素分解复合菌系用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50℃培养5～8天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的1%～2%；

B、取出菌液用磷酸缓冲液（以下简称PBS）按照1:10000～1000000的体积比进行稀释；

C、稀释后的菌液用平板培养，平板为添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0.5%～1%，在50℃培养5～8天； 

D、挑取单个菌落用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50℃培养5～8天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的1%～2%； 

E、取能够降解滤纸的菌液，用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50℃培养5～8天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0.5%～1%；

所述的A、D、E步骤在Hungate厌氧管中进行，C步骤在厌氧罐中进行。

重复D、E步骤3～4次。

所述的滤纸被秸秆取代。