[发明专利]生物催化制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯及菌株

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株具有R-羰基还原酶活性的菌株——季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)X25，及其在生物催化法制备光学纯6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。 

(二)背景技术

手性药物在许多疾病的防治中具有重要意义，其合成研究受到学术界、企业以及政府的高度重视。具有特定功能基团的手性醇更是许多手性药物合成的关键手性砌块，并且在制药、农药、香料等精细化工方面有着十分广泛的应用。 

心血管疾病成为对人类最具威胁的疾病之一，其发病率和死亡率均已超过恶性肿瘤性而跃居第一。据世界卫生组织统计，全世界每年有3000多万人死于心脑血管疾病。中国每年因心脑血管疾病及并发症死亡病例超过300万。积极治疗高血脂症是预防心脑血管疾病的关键，降血脂药物开发已经成为全球药物研究的重点和热点。他汀类药物是目前主要的降血脂药物，其对胆固醇生物合成过程中的限速酶——3-羟基-3-甲基辅酶A(HMG-CoA)还原酶具有显著抑制作用，降低细胞游离胆固醇水平，反馈性上调细胞表面低密度脂蛋白受体表达，促进循环血液中极低密度脂蛋白胆固醇残粒和低密度脂蛋白的清除，最终降低血清中总胆固醇和低密度脂蛋白的水平，有效防止动脉粥样硬化和冠心病的发生。 

全球开发和在研的他汀类药物已有十多个品种。第一代他汀药物包括辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀，是一类结构类似的真菌代谢物。第二代 他汀包括化学合成的外消旋氟伐他汀。第三代他汀是合成的光学纯他汀药物，如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀。他汀类降脂药占世界降脂药市场的85％以上份额，并仍具有提升空间。 

手性β，δ-二羟基己酸(酯)结构是合成他汀药物的药效基团、手性砌块，也是合成他汀药物的重点和难点。他汀类药物的最终质量取决于手性侧链对应异构体的光学纯度，各国药监部门要求ee值大于99.5％，de值大于99％。6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯是他汀类药物合成的手性砌块，合成工艺包括化学不对称合成和生物不对称合成。6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯化学合成方法存在诸多缺陷，合成需要使用剧毒的三乙基硼和-85℃深冷条件，而且非对映诱导不充分，产物6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯de值低，该反应形成的硼化物废物处理需要经过繁琐的反复甲醇淬灭、真空蒸馏等。与化学方法相比，生物合成法具有以下优点：(1)立体、区域和化学选择性高，这主要是因为酶对底物、产物的严格的专一性识别；而使用化学合成方法时，只有当羰基两边的基团差异很大时才能获得较高的立体选择性；(2)安全性与环境相容性好，生物催化安全且反应条件温和，通常以水溶液作为反应体系，环境友好。 

具有羰基还原酶(醇脱氢酶)活性微生物广泛存在于自然界中，但他们不对称还原羰基往往遵循Prelog还原规则、产物构型为S构型；具有反-Prelog立体选择性羰基还原酶活性的微生物在自然界中非常罕见。迄今为止，文献报道的具有不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯活性的微生物菌种有Saccharomyces cerevisiae，Pichia angusta NCYC 495，Pichia angusta NCYCR320，Pichia angusta NCYC R322，Pichia haplophila CBS 2028，Beauveria bassiana，Pichia pastoris，Pichia membranefaciens，Pichia angusta，Candida  humicola，Candida solani，Candida diddensiae，Candida friedrichii，Kluyveromyces drosophilarum，Debaromyces hansenii。目前，未见Pichia guilliermondii具有(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯非对映选择性羰基还原酶活性的报道。 

(三)发明内容

本发明目的是克服现有的6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯生产技术的不足，提供一种从土壤中富集、筛选具有高立体选择性羰基还原酶活性微生物菌种——季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)X25，及其在生物不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。 

本发明采用的技术方案是：