[发明专利]β-葡萄糖苷酶Cel1b及其表达基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及β-葡萄糖苷酶Cel1b及其表达基因与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

地球上存在丰富的木质纤维素资源，其在可循环替代能源及基础化合物生产方面具有巨大的应用潜力。自然界存在许多可有效降解转化木质纤维素的微生物，其对木质纤维素的降解过程构成了地球碳循环的一个重要方面，如瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是最重要的代表菌株。它主要通过分泌纤维素酶来降解纤维素，主要包括外切葡聚糖苷酶、内切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等。真菌所产生的纤维素酶大部分都是诱导酶，通过添加诱导物及对纤维素酶合成途径进行调控是提高纤维素酶活性的有效方法。现在人们普遍认可的一个观点是：从不溶性纤维素底物中释放的某些可溶性寡糖是诱导纤维素酶表达的真正诱导因子，这主要是因为某些二糖如纤维二糖(cellobiose)、δ-纤维二糖内酯(δ-cellobiono-1，5-lactone)、乳糖(lactose)及槐糖(sophorose，由2个葡萄糖通过β-1，2糖苷键连结的双糖分子)等均具有较强的纤维素酶诱导能力。

纤维寡糖常用于纤维素酶水解机理和动力学的研究(Guimaraes等，J MolBiol，320(3)，587-96，2002)；纤维寡糖还用于研究微生物对纤维素的利用过程，包括纤维素酶合成调控、细胞生长和生物产能。另外纤维寡糖具有肠道调节作用，可作为功能性食品或食品添加剂，也可作为糖尿病患者的甜味剂(如纤维二糖)；纤维寡糖还可以应用于化妆品工业和制药工业，其应用前景非常广阔。

纤维寡糖制备应用最广泛的方法是发烟盐酸法(Miller，G.L等，Archives of Biochemistryand Biophysics，1960，91(1)，1-26.)，也可以采用采用混合酸法水解结晶纤维素法(Zhang，Y.H.等，Anal Biochem，2003，322(2)，225-32.)。但这些方法需要消耗大量的盐酸或者硫酸，成本很高，并且也给环境造成很大污染。

近年来，β-葡萄糖苷酶被应用于合成生物寡糖以代替化学合成法(Saloheimo，M.等，ApplEnviron Microbiol.2002，68：4546-4553.)。目前普遍认为存在2种反应类型：水解反应的逆反应和转糖苷反应。在高浓度葡萄糖存在的条件下，两个葡萄糖单元能绑定到β-葡萄糖苷酶的活性位点上，在这两个葡萄糖之间形成一个糖苷键。至少一个葡萄糖可以绑定到酶上，在这些葡萄糖单元之间，β-1-2和β-1-4-糖苷键都能形成。

但现有明确转糖基作用的β-葡萄糖苷酶种类少，应用条件受限较大。因此寻找新的具有转糖基作用的纤维素酶对于利用纤维素具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供β-葡萄糖苷酶Cel1b及其表达基因与应用。

一种表达β-葡萄糖苷酶Cel1b的基因cel1b，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述β-葡萄糖苷酶Cel1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所涉及的基因cel1b来自瑞氏木霉QM9414，在本发明的实施例1中提供了该基因cel1b及β-葡萄糖苷酶Cel1b的制备方法。该方法是以瑞氏木霉QM9414的总RNA为模版，经反转录PCR方法得到cDNA，用特异性寡核苷酸引物通过PCR方法得到β-葡萄糖苷酶Cel1b的cDNA。该序列由1452个核苷酸组成，编码484个氨基酸。然后通过异源表达基因cel1b获得β-葡萄糖苷酶Cel1b。β-葡萄糖苷酶Cel1b具有转糖基活性，HPLC分析表明Cel1b可以将部分葡萄糖转化为纤维二糖，将部分纤维二糖转化为纤维三糖和纤维四糖。

一种重组载体，该载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的功能片断。

一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组载体或表达上述β-葡萄糖苷酶Cel1b。

上述基因cel1b，β-葡萄糖苷酶Cel1b、重组载体或重组细胞在合成纤维寡糖中的应用。

有益效果

本发明中的β-葡萄糖苷酶Cel1b可以用于工业上合成价格昂贵的纤维寡糖，进而应用于研究纤维素酶水解机理、微生物对纤维素的利用过程等。另外这种体外生物法合成的纤维寡糖可作为功能性食品或食品添加剂，也可作为糖尿病患者的甜味剂(如纤维二糖)，还可以应用于化妆品工业和制药工业，其应用前景广阔。

附图说明