[发明专利]兔抗猪TPO多克隆抗体的制备与应用

说明书

技术领域

本发明属于生命科学技术领域，具体涉及一种兔抗猪TPO（甲状腺过氧化物酶，thyroid peroxidase）多克隆抗体的制备及应用。

背景技术

TPO是一种糖基化血红素蛋白，是催化甲状腺激素合成的关键酶。它参与了两个重要的反应：甲状腺球蛋白酪氨酸残基的碘化和碘化酪氨酸的偶联作用，从而产生T3和T4。TPO是甲状腺微粒体抗原的重要组成部分之一，与自身免疫性甲状腺疾病的发生、发展密切相关。TPO不仅在甲状腺细胞表面表达，还在胞浆中表达，是参与补体介导的细胞毒性的细胞表面抗原，具有特殊的免疫学特性。正常时，TPO不会溢出甲状腺入血，但当甲状腺发生病变时，滤泡细胞结构会受到破坏，TPO就会由被隔绝于甲状腺滤泡细胞腔边缘向外周血溢漏，并作为AITD一种重要自身抗原刺激机体免疫系统产生甲状腺组织成分抗体即TPO-Ab，通过激活补体和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用对甲状腺造成免疫性损伤。目前关于猪TPO蛋白的抗体尚无商业化产品，限制了对猪TPO蛋白生物学功能的深入分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性好、纯度高、可与甲状腺细胞的TPO蛋白发生特异性结合反应的兔抗猪TPO多克隆抗体的制备及应用。

本发明的具体实施步骤如下：

步骤(1).经DNAStar软件分析后，将猪的TPO蛋白N端第95                                                113位20个氨基酸作为兔抗猪TPO多克隆抗体抗原表位，氨基酸序列如下：

GluThrAlaValGlnGluValLysArgArgValCysArgArgArgAspThrAspGluLeu。

步骤(2).用多肽自动合成仪化学合成猪的TPO多肽并纯化，纯化后与载体蛋白KLH偶联，形成猪的TPO多肽-KLH复合蛋白；

步骤(3).将猪的TPO多肽-KLH复合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多点注射，先后注射三次，每次间隔710天；

步骤(4).第三次注射1012天后，收集、分离得到含有兔抗猪TPO多克隆抗体的血清；ELISA检测血清中兔抗猪TPO多克隆抗体的效价；

所述的兔抗猪TPO多克隆抗体，其效价在1:50000以上；

步骤(5).将步骤(2)合成并纯化的猪的TPO多肽与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联，制备多肽亲和层析柱；

步骤(6).将含有兔抗猪TPO多肽抗体的血清加入到步骤(5)制备的多肽亲和层析柱中，并在4℃孵育过夜后，洗脱抗体，得到兔抗猪TPO多克隆抗体；

所述的步骤(2)猪的TPO多肽的纯化，采用HPLC对其进行纯化，使猪的TPO多肽的纯度达到95%以上；

所述的步骤(6)兔抗猪TPO多克隆抗体的纯化，采用免疫亲和纯化的方式。

兔抗猪TPO多克隆抗体应用广泛，可与猪甲状腺细胞TPO蛋白发生特异性结合反应，可用于免疫组化等实验的要求。

本发明有益效果如下：

本发明制备的抗TPO多克隆抗体具有特异性好、纯度高的特点。本发明兔抗猪TPO多克隆抗体的制备，为深入研究猪TPO蛋白的生物学功能和在甲状腺细胞水平调控猪的生长发育提供了一个重要工具，具有重要的理论意义和生产价值。

附图说明

    图1 为本发明在猪甲状腺细胞中的免疫组化染色。

具体实施方式

    下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1： 

兔抗猪TPO多克隆抗体的制备步骤如下：

步骤(1).经DNAStar软件分析后，将猪的TPO蛋白N端第95113位20个氨基酸作为兔抗猪TPO多克隆抗体抗原表位，氨基酸序列如下：

GluThrAlaValGlnGluValLysArgArgValCysArgArgArgAspThrAspGluLeu。

步骤(2).用多肽自动合成仪化学合成猪的TPO多肽并纯化，纯化后与载体蛋白KLH偶联，形成猪的TPO多肽-KLH复合蛋白；

步骤(3).将猪的TPO多肽-KLH复合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多点注射，先后注射三次，每次间隔710天；

步骤(4).第三次注射1012天后，收集、分离得到含有兔抗猪TPO多克隆抗体的血清；ELISA检测血清中兔抗猪TPO多克隆抗体的效价；

所述的兔抗猪TPO多克隆抗体，其效价在1:50000以上；