[发明专利]发酵法制取谷氨酸脱氢酶的工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及到一种谷氨酸脱氢酶的发酵制备方法。

背景技术

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)是谷氨酸生物合成过程中的关键酶，它广泛分布于细菌、酵母、植物和哺乳动物组织中，是连接碳、氮代谢的重要酶类，催化谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸和氨，氨基被用于许多其他氨基酸的合成中。目前，谷氨酸脱氢酶已应用到医疗诊断中，也是制备尿素氮试剂盒(速率法)的必需酶之一。

从1960年开始，国内外对其他细菌来源的谷氨酸脱氢酶已开始进行分离和研究。但对谷氨酸生产菌中谷氨酸脱氢酶的报道较少，谷氨酸棒杆菌中的谷氨酸脱氢酶的提取纯化相关报道很少，国内尚未实现菌株发酵制备谷氨酸脱氢酶的规模化生产，致使国内研制尿素氮试剂盒所用的谷氨酸脱氢酶大多从国外进口，因此试剂盒的成本较高，为降低其成本必须解决谷氨酸脱氢酶的制备问题，因而对谷氨酸脱氢酶的菌株发酵制备工艺进行深入的研究，将为指导工业生产提供重要的依据。

发明内容

本发明的目的是提出发酵法制取谷氨酸脱氢酶的一种工艺，本工艺可以有效提谷氨酸脱氢酶的产量和产品纯度，提高产率，降低生产成本。

发酵法制取谷氨酸脱氢酶的一种工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)谷氨酸棒杆菌CQ920的发酵

谷氨酸棒杆菌CQ920接种于普通肉汤培养基上，32℃培养36h进行活化，活化1～2次；将3-4块0.5-1.0cm²活化后的菌株接入灭菌冷却后的种子培养基内，32℃，180rpm培养10-12h；培养获得的种子培养液以8％的接种量转入灭菌冷却后的发酵培养基内，控制发酵温度及通风，发酵过程中流加10％的尿素控制pH值为7.5左右，当残糖浓度降至一定值时开始加入50％的葡萄糖溶液，流加糖总时间为10h左右。

(2)谷氨酸脱氢酶粗酶液的制备

菌株发酵液离心，用0.2％的KCl洗涤数次，取定量湿菌体，按比例加入pH 7.5的25mm的Tris-HCl缓冲液，菌体悬液在4℃用超声波细胞破碎仪处理2次，每次20min，离心去沉淀，获得谷氨酸脱氢酶粗提液。

(3)离子交换层析

谷氨酸脱氢酶粗提液上样于25mm Tris-HCl(pH 7.5)平衡的DEAE-纤维素柱，用含0.2-0.6mm NaCl的25mm Tris-HCl(pH 7.5)梯度洗脱，分布收集，合并活性部分。

(4)疏水层析

离子交换层析液用PEG6000浓缩后，上样于用含1m硫酸铵的25mm Tris-HCl(pH 7.5)平衡的疏水柱HiPrep，用含1m硫酸铵的25mm Tris-HCl(pH 7.5)和含50％乙二醇的25mm Tris-HCl(pH 7.5)梯度洗脱，分步收集，合并活性部分。

(5)凝胶过滤层析

疏水层析收集液用截留分子量为12000U的透析袋透析4h，用PEG6000浓缩后上样于用含0.2m NaCl的25mm Tris-HCl(pH 7.5)平衡的凝胶过滤柱SuperdexG-200，用相同的缓冲液洗脱，分步收集，合并活性高的部分。

(6)超滤

将凝胶过滤层析收集液用截留分子量10000U的超滤器于5000r/min，4℃离心5-6h。

(7)成品：取离心后上部超滤液，冷冻干燥，获得谷氨酸脱氢酶成品。

本发明提供的上述以发酵法制取谷氨酸脱氢酶的工艺，其特点在于：

(1)诱变筛选获得高产谷氨酸脱氢酶菌株，菌株发酵性能稳定，发酵液内谷氨酸脱氢酶含量高，酶活性高，为后期发酵工艺的优化及产物的提取奠定了基础；

(2)菌株发酵培养基内加入了稀土元素，有效提高了谷氨酸脱氢酶的活性，优化后菌株发酵酶活达到110U/mL，为国内已报道中最高水平；

(3)采用柱层析进行谷氨酸脱氢酶的纯化，可有效提高终产品的比酶活，同时降低杂质对产物的影响，有效实现终产品的稳定性和高效性；

(4)利用液体发酵制备谷氨酸脱氢酶，与传统提取法相比，具有周期短、产量大、成本低等优点，制备获得的谷氨酸脱氢酶的比酶活高于260U/mg。

附图说明

附图1为发酵法制取谷氨酸脱氢酶工艺流程图，经菌株发酵制备获得的谷氨酸脱氢酶成品比酶活高于260U/mg。

具体实施方式

提出以下实例来具体说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。