[发明专利]一种基于数字微镜器件的高速结构照明光学显微系统及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种结构照明显微系统，可以实现高速的光学超分辨和三维层析显微成像，可广泛用于生物学、医学，生物物理以及材料化学等领域的研究。

背景技术

现代生物学和材料科学的发展对微观结构的研究提出了越来越高的分辨率需求，希望从分子水平揭示生命过程和材料性能的物理本质。受光学衍射极限的限制，普通光学显微镜的横向分辨率一般只能达到200nm，纵向分辨率约500nm。这对于研究亚细胞结构和分子结构已无能为力。虽然电子显微镜和原子力显微镜可以达到亚纳米的分辨率，但是其只能对非活性离体细胞样品进行观测的缺点限制了其在生物领域的广泛应用。

光学显微成像技术根据探测模式可以分为两大类：即点扫描成像技术和宽场成像技术。

以激光共聚焦荧光显微为代表的点扫描成像技术，用高度聚焦的激光束对样品逐点扫描成像，荧光信号经过探测针孔滤波后被光电倍增管探测收集，由于只有激光焦点处激发的荧光可以通过探测针孔，所以激光共聚焦显微具有极低的背景噪声，而且通过逐层扫描样品，可以实现三维成像。但是激光共聚焦荧光显微的横向分辨率并没有超过衍射极限。多光子荧光显微与共聚焦显微很类似，不同的是它使用超短脉冲激光作为激发光源，由于多光子吸收是非线性效应，只发生在焦点处，所以探测器前不需要针孔滤光，并且由于激发光使用长波段的近红外光，具有探测样品更深层结构的能力。

宽场成像技术采用面阵图像传感器(如CCD)，可以在一个时间点获得一幅完整的二维图像，具有速度快、图像灰度级高等优点。但是由于受样品离焦部分的干扰，普通的宽场成像技术不具有三维层析成像能力。近年来，随着各种新型荧光探针分子的出现和成像方法的改进，远场光学成像的分辨率已经突破了衍射极限的限制。其中方法之一是利用结构照明的显微技术(SIM)。SIM是一种宽场光学显微技术，使用面阵CCD并行采集图像，与普通宽场显微不同的是它还具有三维层析成像的能力。

结构照明超分辨显微的基本原理：

显微物镜的空间分辨率取决于它能采集到的最大空间频率f₀，f₀取决于显微物镜的光学传递函数，f₀＝2NA/λ。当样品包含的高频信息f＞f₀时，样品的细节将难以被分辨。如果使用空间频率为f₁的正弦条纹结构光照明样品，则会产生空间频率为f_m＝|f-f₁|的低频莫尔条纹(Moiréfringes)。莫尔条纹实际上是样品与结构光的拍频信号，它包含有样品超衍射分辨的高频信息f。当f_m＜f₀时，莫尔条纹可以在显微物镜下观察到，通过软件解码，可以提取出样品的超分辨率信息，重组出样品的高分辨率图像。从频域来看，SIM将物镜能收集到的最大空间频率从f₀提高到了f₀+f₁。因此f₁越大，SIM显微的空间分辨率就越高。但是结构照明光场的空间频率f₁是受衍射极限限制的，当f₁＞f₀时，它将不能被分辨。因此，SIM显微最大可以将光学显微系统的空间分辨率提高一倍。结构照明三维层析成像显微的基本原理：普通的宽场显微由于显微物镜有一定的景深，因此CCD相机得到的图像实际上是像面信息和非像面信息的叠加。其中像面信息称为目标，非像面的信息成为了背景。正是由于非像面信息(背景)的干扰和影响，使得在研究像面信息(目标)时，成像的信噪比和空间分辨率受到了很大的限制。结构照明层析技术使用高空间频率的结构光场对样品进行照明，能把宽场成像中的像面信息和非像面信息有效地分离，从而得到光切片或者层析图。通过使用位移平台在与光切片垂直的方向作线性扫描，可以得到样品的三维层析图。

结构照明层析技术使用三步相移光场，使成像中的像面信息与非像面信息有效地分离。具体做法是：把正弦结构光场的初相位依次设定为0⁰、120⁰、240⁰，分别照明样品，并使用CCD相机采集图像，依次对应记录为I₀，I₁₂₀，I₂₄₀；通过下列公式算法，计算出某一纵向位置z处的宽场层析图I_z(x，y)：