[发明专利]通用ACTB基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种操作简便、快速，且能够定量检测人、大鼠、小鼠三个物种β-肌动蛋白(Beta-actin，ACTB)基因mRNA表达的DNA体外扩增试剂盒，该发明属于分子生物学检测技术中的荧光定量DNA体外扩增技术领域。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是现有的DNA体外扩增技术中最常用、也是最有效的技术；该技术系将耐热DAN聚合酶、特异引物、dNTPs底物、模板DNA、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，从而达到靶DNA片段在反应液中呈2n倍扩增(其中n为热循环次数)；荧光定量PCR技术则在PCR反应的基础上，耦合以实时荧光检测和计算机分析技术，即在PCR反应体系中加入特定的荧光物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光变化情况来实时探测DNA的扩增情况，并获得每个标本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值(荧光变化达到阈值时的循环数)；同时，在相同的反应体系和反应条件下检测4-5个倍数稀释的已知数量的靶标DNA，获得其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定；TaqMan探针技术是目前最常用的荧光定量PCR技术；TaqMan探针是一条能够与待扩增检测的靶DNA序列互补配对的寡核苷酸，其5’端标记了一个荧光报告基团(R)，其3’端标记了一个荧光淬灭基团(Q)；当该探针处于游离状态或者没有发生反应时，R所产生的荧光将被Q淬灭；在PCR退火过程中，该探针可与目标基因发生杂交，并由TaqDNA聚合酶的依赖于聚合的外切活性切断，使得R与Q分离，游离的R发出荧光被荧光检测装置检测；随着PCR反应的进行，游离的R与PCR产物相对应地增加；因此，根据R产生的荧光信号的强弱，即可间接测量出PCR反应产物的数量；再依据标准曲线即可对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。

在荧光定量PCR检测中，经常遇到检测基因相对表达量的情况，其中内对照基因常常选择ACTB；有鉴于此，我们通过大量的实验研究优选出了一套能够有效检测人、大鼠、小鼠三个物种ACTB基因表达的引物和探针，优化出了其PCR反应的条件，并组装成通用ACTB基因表达检测荧光定量聚合酶链反应试剂盒，以满足生命科学研究和医学检测的需要。

发明内容

本发明的技术方案是：首先获得人、大鼠、小鼠的ACTB标准序列，进行BLAST同源性比较，再根据比较结果设计相应的引物和探针，最后将引物、探针加入含有耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板cDNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系中，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环；并在中温时检测和记录荧光值。

所优选出的引物和探针的序列分别如下：

上游引物P1：5’-GAA GAT CAA GAT CAT TGC TCC T-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物P2：5’-TGG ATC AGC AAG CAG GAG TA-3’(SEQ ID NO：2)；

TaqMan探针序列：5’-FAM-CTG TCC ACC TTC CAG CGA-TAMRA-3’(SEQ ID NO：3)

所优化出的PCR扩增缓冲反应体系是由引物、探针、耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg²⁺、PCR缓冲液、超纯水等组成的，各个成分的终浓度分别如下：特异的引物和探针每条0.28umol/L、Taq DNA聚合酶1.5/50ul、dNTPs底物0.25mmol/L、模板cDNA若干、Mg²⁺2.5mmol/L、缓冲液1×PCR；其中1×PCR缓冲液包括50mmol/L KCl、10mmol/LTris·HCl PH8.3、0.01％明胶。

该ACTB荧光定量PCR由于引物和探针在人、大鼠、小鼠中完全同源，所以能够有效扩增来源于这些物种的ACTB基因，从而检测ACTB基因的表达量。

根据上述研究结果，将上述引物、探针和其他PCR试剂混合后分装到PCR扩增管中，并配以10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML等系列稀释度的标准ACTB基因模板组装成通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒。标准ACTB基因模板的序列为：