[发明专利]人乳头瘤病毒(HPV)16,18型多通道荧光PCR检测方法与试剂盒

权利要求书

1.人乳头瘤病毒(HPV)16，18型多通道荧光PCR检测方法与试剂盒，其特征在于，试剂盒包括：PCR反应液1、PCR反应液2、HPV16、18型探针、内参荧光探针、Mgcl2、Taq酶、DNA提取液、阳性校准品、临界阳性校准品、阴性对照。

2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒(HPV)16，18型多通道荧光PCR检测检测方法与试剂盒，其特征在于，在Taq酶加入了防污染的UNG酶，在50℃时其能有效降解扩增前存在于反应体系中包含dUTP的DNA片段。

3.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒(HPV)16，18型多通道荧光PCR检测方法与试剂盒，其特征在于，利用HPV16的早期开放读码框架E7设计一对HPV16特异性引物和特异性探针，利用HPV18的早期开放读码框架E1设计一对HPV18特异性引物和特异性探针，并且管家基因三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参对照设计了另外一对特异引物和探针以检测取样和提取的效果。其序列如下：

HPV16的引物与探针：

HPV16F：5’AGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGT3’

HPV16R：5’AGAGTCACACTTGCAACAAAAGGT3’

HPV16P：5’ACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCAT3’

HPV18的引物与探针：

HPV18F：5’ATTTTGTGAACAGGCAGAGCTAGA3’

HPV18R：5’AACCGTGGACTTAACTCTGTATCCA3’

HPV18P：5’ACAGCACAGGCATTGTTCCATGCG3’

GAPDH的引物与探针：

GAPDHF：5’TGTGGCTCCCTTGGGTATATG3’

GAPDHR：5’CATCGCCCCACTTGATTTTG3’

GAPDHP：5’CCCCCACCCCCATAGGCGAGAT3’。

4.根据权利2所述的一种人乳头瘤病毒(HPV)16，18型多通道荧光PCR检测方法与试剂盒，其特征在于，阳性校准品中包含了三段人工合成的核苷酸片段，即HPV16引物(HPV16F、HPV16R)、HPV18引物(HPV18F、HPV18R)和内参对照GAPDH引物(GAPDH F、GAPDH R)扩增的3段序列而合成的3条核苷酸片段。核苷酸片段序列如下：

HPV16 E7 Seq：

AGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGC 

CCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCT

HPV18 E1 Seq：

ATTTTGTGAACAGGCAGAGCTAGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATGCGCAGGAGGTCCACAATGATGCACAAGTGTTGCATGTTTTAAAACGAAAGTTTGCAGGAGGCAGCACAGAAAACAGTCCATTAGGGGAGCGGCTGGAGGTGGATACAGAGTTAAGTCCACGGTT

GAPDH Seq：

TGTGGCTCCCTTGGGTATATGGTAACCTTGTGTCCCTCAATATGGTCCTGTCCCCATCTCCCCCCCACCCCCATAGGCGAGATCCCTCCAAAATCAAGTGGGGCGATG。

5.根据权利要求3所述的人乳头瘤病毒(HPV)16，18型多通道荧光PCR检测方法与试剂盒，其特征在于，标记探针的荧光发光基团为FAM、TET、JOE、CY3、CY5、CY5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine 6G、Orengon Greeen 488、Orengon Greeen 500、Orengon Greeen 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine Orange或ROX中的任意一种或一种以上的组合，荧光猝灭基团为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一种或一种以上组合。