[发明专利]人脐血间充质干细胞的核细胞的分离及培养方法

权利要求书

1.一种人脐血间充质干细胞的核细胞的分离及培养方法，其应用于人脐血间充质干细胞分化为神经元细胞的二甲基亚矾诱导过程，所述诱导过程包括步骤：脐血的收集和单个核细胞的分离、细胞的培养、纯化及扩增、定向诱导MSCs以及免疫组织化学鉴定；其中所述脐血的收集和单个核细胞的分离方法包括：

无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的脐带血40-60ml，肝素抗凝，浓度为20U/ml，所有样本均于采集后12h内分离；

用Hank’S平衡盐溶液1∶1稀释、混匀，叠加于Fieoll-Hypaque上面，相对密度为1.0779/L，稀释血与Fieoll-Hypaque液的柱高比为2∶1，以2000r/min离心20min，取界面层的单个核细胞；以及

加Hank’S平衡盐溶液离心、洗涤两次，加入培养基中，调整细胞浓度为1x10⁶/ml左右。

2.如权利要求1所述的人脐血间充质干细胞的核细胞的分离及培养方法，其中所述细胞的培养、纯化及扩增方法包括：

培养基采用Mesencult^TM培养液，并调整其pH值使呈偏酸性，加入1％的Pen-strep，将细胞分装于25T培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的培养箱中培养48-72h后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3-5d半量换液一次；

待细胞达到80％-90％融合时，用1∶1的2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA混合液消化，然后按2∶1的比例进行传代接种培养，并记为P₁代；

传代培养过程中每3d半量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作，传代培养记为几代，其余类推。