[发明专利]一种柠檬明串珠菌发酵生产交替糖蔗糖酶的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种柠檬明串珠菌SK24.002发酵生产交替糖蔗糖酶的方法及应用，属于食品生物技术领域。

背景技术

现今社会，人类生活节奏加快、社会竞争激烈、饮食结构改变、环境污染等，都严重威胁着人类的健康，使得大多数的人群都处于亚健康状态。目前，广大公众对自身健康状况日益关注，有越来越多的人选择使用食物来改变这种状况，从“治已病”为主前移到“治未病”和养生保健，从“被动医疗”转向“主动健康”。为了顺应现代食品科技发展的方向并满足消费者的健康需求，低血糖、低热量的功能性碳水化合物已成为21世纪健康食品的发展潮流。

葡聚糖蔗糖酶（glucansucrase，GS，EC.2.4.1.-），又称葡糖基转移酶，是催化葡糖基特异性转移的酶，属于淀粉水解酶GH70家族，反应类型主要有三类：

（1）水解反应：sucrose+H₂O→glucose+frucose

（2）聚合反应：sucrose+glucan_n→glucan_n+1+frucose

（3）受体反应：sucrose+disaccharide/trisaccharide→oligosaccharides+frucose

交替糖蔗糖酶（Alternansucrase）是一种新型的葡聚糖蔗糖酶，主要由植物细胞或微生物细胞产生，在糖代谢过程中参与蔗糖的转移与利用。目前，交替糖蔗糖酶的研究机构主要集中在欧美国家，相关报道仅局限于酶分子核酸序列与生物学性质研究，国内在此领域研究并不多见。

本发明人深入调查和研究了现有技术并对各种交替糖蔗糖酶生产方法进行了研究，最终我们发现柠檬明串珠菌发酵生产交替糖蔗糖酶的方法并能生物合成新型的功能性碳水化合物。基于上述发现提出了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柠檬明串珠菌SK24.002发酵生产交替糖蔗糖酶的方法及应用，属于食品生物技术领域。

本发明使用的柠檬明串珠菌是本发明人等先前从我国传统发酵泡菜中分离得到，其分类名为柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）SK 24.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2011398，保藏日期2011年11月18日。

本发明的技术方案：一种用柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）SK24.002发酵生产交替糖蔗糖酶的方法，步骤为：

（1）以柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）SK24.002为出发菌株，进行斜面、种子、发酵三级培养；

斜面培养（g/L）：葡萄糖1~5 ，酵母粉5~10，无水氯化钙0.02~0.025，磷酸氢二钾10~15，七水合硫酸镁0.2~0.5，一水合硫酸锰0.01~0.015，Vc 0.03~0.05，琼脂20，pH6.8~7.0，121℃灭菌20min。培养条件：培养温度30~37℃，培养时间10~18h。

种子培养（g/L）：葡萄糖5~10，酵母粉10~20，无水氯化钙0.02~0.025，磷酸氢二钾10~15，七水合硫酸镁0.2~0.5，一水合硫酸锰0.01~0.015，Vc 0.03~0.05，pH6.8~7.0，121℃灭菌20min。培养条件： 100mL三角瓶装液40mL，将斜面培养后的斜面培养基按体积百分比5%~10%接入种子培养基中，培养温度30~37℃，摇瓶转速160rpm，培养时间8~12h。

发酵培养（g/L）：蔗糖20~40，酵母粉10~20，无水氯化钙0.02~0.025，磷酸氢二钾10~15，七水合硫酸镁0.2~0.5，吐温80 5~10mL/L，Vc 0.03~0.05，pH6.8~7.0，121℃灭菌20min。培养条件：将种子培养后的种子培养基按体积百分比5%~10%接入发酵培养基中，培养温度30~37℃，摇瓶转速160rpm，培养时间12~24h。

（2）从发酵液中分离纯化得到交替糖蔗糖酶酶粉；

将步骤（1）制得的发酵液经离心或板框过滤分离发酵上清液与微生物菌体，其中发酵上清液经超滤去盐和杂蛋白，再用50%的聚乙二醇沉淀，离心得到沉淀1；微生物菌体悬浮于8M、pH5.4的脲-醋酸钠缓冲液中，25℃下振摇1~4h，离心得到上清液，透析处理后再用50%的聚乙二醇沉淀，离心得到沉淀2，最后将上述两步骤所得沉淀合并冷冻干燥得到交替糖蔗糖酶酶粉。