[发明专利]SNX7基因调节胚胎肝脏细胞发育的方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及利用SNX7基因表达水平调节斑马鱼胚胎肝脏细胞发育，以及含有该基因的表达产物和应用。

背景技术

肝脏是包括人在内的脊椎动物中最大的消化腺，它参与体内多种物质的消化，储存，合成，分泌等过程，同时，它还是主要的解毒器官。肝脏相关的疾病是对人类健康的主要威胁之一。阐明肝脏的发育，功能及再生的分子机制是生物医学领域面临的一个重要问题。斑马鱼是研究脊椎动物肝脏发育的良好模型：斑马鱼的体外发育以及早期胚胎的透明性使得能够实时连续观察肝脏的发育过程；斑马鱼中成熟的正向和反向遗传学技术使能够快速有效地确定特定基因的体内功能；斑马鱼早期的器官发育不需要通过血液循环提供的营养，而且斑马鱼的肝脏不参与胚胎期的造血过程，这非常有利于排除一个基因间接的对肝脏发育的影响，而研究它是否对肝脏发育起直接的调节作用。

Sorting Nexins(SNXs)是一类具有PX结构域的蛋白，这些蛋白中不同的PX结构域能与不同磷酸化水平的磷脂酰肌醇结合并将相应的SNX蛋白定位到细胞内不同的内膜系统上。在小鼠和人的基因组中，迄今已有超过30个SNX编码基因被鉴定和克隆了。一系列的体外研究表明他们的主要功能是调节包括表皮生长因子受体(EGFR)等在内的一系列细胞表面蛋白的内吞及细胞内蛋白的分选(sorting)过程。相对于分子与细胞水平已开展的工作，关于SNX基因在生物个体的胚胎发育及成体的生理功能方面的研究却非常有限。基因敲降(knockdown)是反向遗传学的一种常用技术，它通过人为抑制特定基因的表达产生的相关表型来研究该基因的生理功能。特别地，对于所采用的斑马鱼这种模式生物，基因敲降技术采用得非常普遍且拥有其他模式生物所不具备的优势。在斑马鱼中，是采用注射反义核苷酸Morpholino的方法来完成对特定基因表达的敲降的。

斑马鱼作为一个较新的模式生物，其应用的一个主要方面就是被用来进行早期器官发育的研究，与研究最多、应用最广的小鼠相比，斑马鱼作为发育学研究的模式生物具有以下特点：

斑马鱼非常便于饲养、人工繁育和品系保持，正常培养的雌雄鱼每周都能够交配，每次可产生数以百计的后代(受精卵)，这为大规模的筛选和运用统计学方法进行研究在短时间内提供了大量的研究样本。

斑马鱼发育周期非常短，在受精之后24小时内，几乎所有的器官和系统都已经开始发育，在受精之后的5天内，所有的器官和系统都已经具有了完整的功能，此时的幼体斑马鱼已经具有各种完整地生理行为。

斑马鱼的胚胎是在体外完成整个生理发育过程的，这不仅可以通过一部简单的光学显微镜就能观察到其发育全过程，而且与哺乳动物相比，其受精卵的发育过程由于独立于母体，省去了一系列用来支持和提供养分的附属结构；斑马鱼早期发育的胚胎是完全透明的，从光学显微镜和解剖镜下，能够实时清晰地观察某一特定部位、系统、器官和组织的发育，能够得以方便地全程监控所感兴趣的发育过程。

在较短的时间内，斑马鱼研究的前驱科学家们已经建立的一套系统的研究方法，并积累起了大量的研究数据。斑马鱼全基因组比对已经接近完成，人和小鼠的绝大部分基因都能在斑马鱼基因组数据库中找到其对应的同源基因。众多转基因斑马鱼品系已经建立，目前具有的数千种转基因斑马鱼品系中几乎涵盖了所有组织器官，用荧光等标签特异性标记了某一部位和器官的转基因斑马鱼品系为发育学研究提供了强有力的工具。在斑马鱼胚胎中对某一特定基因进行敲降(knockdown)具有着其他模式生物无法比拟的优势，在这其中，Gene-tools公司所设计的morpholino反义寡核苷酸是应用最广的一种，通过将带有与目标基因互不配对序列的morpholino反义寡核苷酸显微注射到单细胞阶段的斑马鱼受精卵，能够非常方便地完成单个或是多个特定基因的瞬时敲降，morpholino反义寡核苷酸具有极好的水溶性与稳定性，这样的敲降虽是瞬时，但由于前述的斑马鱼发育过程的短暂，敲降的效果可相当稳定地维持于斑马鱼早期胚胎发育的全过程。近几年来，运用锌指蛋白技术，已经成功地完成了基因敲除(knockout)斑马鱼品系的构建。