[发明专利]实时荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及实时荧光定量PCR领域，特别地，涉及一种实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是通过对基因的选择性片段进行体外扩增，以对靶基因进行检测的技术。根据扩增策略和检测产物手段的不同，PCR可分为定性和定量。实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RQ-PCR)是在对靶基因的扩增过程中加入荧光标记探针，同时将核酸扩增、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现对靶基因的准确定量检测。RQ-PCR具有高灵敏性、高精确性和高通量性。

临床中实时定量PCR检验相对于其它临床检验技术而言，虽然具有极高的检测灵敏度，但仍易出现“假阴性”的结果。产生假阴性结果的原因中有一些是可以通过调节仪器、试剂避免的如：靶基因提取过程中的丢失、提取试剂(如有机溶剂等)残留、标本中抑制物去除不彻底、扩增仪孔间温度差异等。现有技术中为进一步的避免假阴性结果最有效的措施是设立“内标”。

非竞争性内标是指内标与靶基因具有不同的引物序列。非竞争性内标与待测靶基因之间不存在引物竞争关系。但使用非竞争性内标时，需要单独设计针对内标的引物、探针。多对引物、探针在反应管中形成多重PCR。使得引物、探针之间出现相互干扰的概率增大。为避免干扰，常用手段为调节引物、探针和内标的浓度。这些手段会加重测试过程优化的难度。

“竞争性”内标是指具有与靶基因相同的引物序列和具有与靶基因不同的探针检测区序列的片段。该内标与靶基因采用相同的引物、内标在扩增过程中，该内标必然与靶基因相互竞争，含量低的一方受到抑制，从而检测待测基因中是否存在抑制。当该内标与靶基因的浓度相差100倍以上时，浓度低的一方就无法扩增。由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物相对逐渐减少。

发明内容

本发明目的在于提供一种实时荧光定量PCR检测方法，以解决当靶基因浓度较高时，使用竞争性内标法时内标受抑制，无法扩增，易出现假阴性的技术问题。

为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)选取目的基因上的同源保守区段，设计与同源保守区段5’端和3’端特异配对的上、下游引物，选取同源保守区段中的第一区段，设计与第一区段配对的第一探针，第一探针的5’端标记第一荧光报告基团；

(2)构建同源保守区段的竞争性内标，并设计竞争性内标的内标探针，内标探针的5’端标记第二荧光报告基团；

(3)在同源保守区段上选取与第一区段间隔的第二区段，设计与第二区段特异互补配对的增补探针；

(4)提取纯化样本基因，合成上下游引物、内标基因的质粒、第一探针、内标探针和增补探针后用于对样本基因进行实时荧光定量PCR扩增；

(5)记录所得荧光信号，判断结果；

增补探针的5’端标记第二荧光报告基团，第二区段和第一区段均位于上、下游引物之间；增补探针的浓度为第一探针的浓度的1/2～1/10。

进一步地，内标探针的Tm值与第一探针的Tm值差值的绝对值小于1℃，内标探针的GC碱基含量百分比与第一探针的GC碱基含量百分比差值为0～8％。

进一步地，内标探针与第一探针的长度相同。

进一步地，内标探针、增补探针在软件primer premier 5.0中的Hairpin的|ΔG|＜4.5，Dimer的|ΔG|＜10，上、下游引物在软件primer premier 5.0中的Cross Dimer的|ΔG|＜10。

进一步地，第一、第二荧光报告基团为6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、2，7-二甲基-4、六氯-6-甲基荧光素、CY3、CY5、LightCycler Red610、LightCycler Red640中的任一种，当第一荧光报告基团为其中一种时，第二荧光报告基团为与之区别的另一种；第一探针、内标探针和增补探针的3’端标记荧光淬灭基团，荧光淬灭基团同时为TAMRA、BHQ、Eclipse、Dabcyl中任一。

进一步地，内标探针、增补探针的长度为20～30bp，T_m值为65～73℃；内标探针、增补探针的T_m值比上、下游引物的T_m值高5～10℃；内标探针、增补探针的GC碱基含量百分比为35％～70％。