[发明专利]一种模拟猪生长激素样的活性肽及制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种模拟猪生长激素样的活性肽，即一种利用噬菌体表面展示技术筛选的，能模拟猪生长激素的多肽，还涉及一种模拟猪生长激素样作用的活性肽及制备方法与应用。

背景技术

猪生长激素由猪垂体分泌，是一种能促进机体生长，调节代谢的蛋白多肽激素。大量研究证明,猪生长激素能显著提高猪生长速度、瘦肉率和饲料报酬,对猪的生产、育种和饲料的调制产生重大的影响。但是因为担心激素残留问题，外源性生长激素被禁止在动物上使用, 因此深入研究生长激素其促生长的机理并寻找安全有效的替代物一直是动物营养学重要的研究方向。

近年来,很多研究利用噬菌体展示肽库技术筛选抗配体技术，在寻找模拟激素的生物活性肽的研究中日益受到重视。噬菌体展示技术是Smith于1985年开创的一种基因表达和亲和选择相结合的技术，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽淘选出来。该技术是近年来新兴的研究配体与受体相互作用位点的强有力的工具。MOTTI针对抗乙肝表面抗原单抗应用随机肽库筛选获得的小肽进行测序,找到了与天然抗原的序列非常相近的氨基酸序列，结果证实筛选的得到的其中一个氨基酸序列与天然抗原氨基酸序列极相似。Wrighton等利用噬菌体位随机肽库中筛选能够模拟EPO分子的活性的环肽，通过受体二聚化的诱导，引起信号传导一系列作用，来促进生长与分化，刺激体内网织红细胞数目的增加，除此之外，TPO模拟肽，药物配体肽等，都有相应的报道。

发明内容

本发明提供一种模拟猪生长激素样的活性肽及制备方法与应用，目的在于克服为了促进动物生长而使用外源生长激素带来残留的不足。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明所述模拟猪生长激素样的活性肽的氨基酸序列为RPCLPHCNSTSD。

 一种模拟猪生长激素样的活性肽及制备方法与应用，包括如下步骤：

（1）以1A3为噬菌体筛选靶标，采用噬菌体随机12肽库进行了四轮淘洗，经噬菌体克隆、回收、富集、扩增后，经间接ELISA检测，发现有若干个噬菌斑阳性克隆与1A3存在特异性结合，将特异性结合的阳性克隆提取ssDNA,进行序列测定及比对分析，即得所述多肽的氨基酸序列。

（2）以筛选到的多肽为基础，对比核心氨基酸序列，以核心氨基酸序列为基础通过计算机软件设计合成多肽，，然后与猪肝细胞膜上生长激素受体进行特异性结合试验，包括竞争性结合，BIAcore分析，受体二聚化分析，信号转导分析，计算机生物学分析等检验筛选出具有生长激素受体结合的多肽，然后证明其生长激素样作用。

本发明利用噬菌体表面展示技术筛选过程如下：选择已获得国家发明专利200510016662.9的单克隆抗体作为筛选靶标，以下简称1A3；之所以选择1A3是因为在以往的试验中我们证实1A3上与生长激素结合的位点和生长激素与受体的结合位点相同，以1A3单克隆抗体包被聚苯乙烯板上（注：，加入噬菌体随机12-肽库（NEB公司商品化肽库），主要按噬菌体展示肽库说明书操作，筛选过程简要介绍为：首先从12-肽噬菌体文库中筛选与1A3特异性结合力的噬菌体，洗涤以去除非特异性结合的噬菌体，后用洗脱液将结合在1A3单克隆抗体的噬菌体洗脱下来，感染大肠杆菌ER2738，扩增后将噬菌体提取纯化，即为第一轮的富集噬菌体，然后进行第二轮与第三轮筛选，过程与第一轮方法一致，只是不断加强洗脱强度，第三轮，四轮筛选方法与前两轮方法一致，经过四轮轮筛选后，得到与生长激素单克隆抗体结合特异性强、亲和力高的噬菌体多肽，再将第三轮筛选的噬菌体单克隆化，并结合ELISA、竞争ELISA挑选出与1A3单克隆抗体有强阳性反应的噬菌体克隆，然后进行鉴定，证明与噬菌体结合位点是噬菌体的PⅢ蛋白质所携带外源多肽。

所述的模拟猪生长激素的活性肽在制备猪促生产制剂中的应用，可应用于生长阶段的猪，通过促进机体合成代谢和脂肪分解，促使蛋白质合成。达到促进猪的生长，提高生长速度的目的。

本发明以生长激素结合蛋白为筛选靶标，通过一系列随机肽库的筛选结合相关的生物技术找到能够模拟生长激素特性的生物活性肽是解决问题的关键。生物活性肽，不是生物激素，只是一种能够模拟激素生物活性的多肽，以模拟生长激素的作用等方式来调节内分泌系统的激素水平，以期达到提高生长速度，改善胴体品质的目的。发挥促进动物生长作用，克服了激素残留的问题，因此对动物的健康绿色养殖具有重大的经济价值和现意义。

本发明具有如下优点和积极效果：