[发明专利]一种基于交联技术的仿生骨界面、构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过同双官交联技术偶联生物信号重组纤维连接蛋白/钙粘附蛋白与双相钙磷陶瓷的仿生学界面。属于界面组织工程领域。

背景技术

为使骨修复材料具有良好的生物活性和组织相容性，可按照仿生学原则进行修饰，即在不改变基体性能的前提下，将生物活性分子固定在人工合成材料或天然材料表面，设计具有特定生物、理化特性的组织工程化材料，将“惰性”界面转变为利于种子细胞提供黏附、增殖和分化信号的生物界面。

细胞在基材表面的特异性黏附主要由吸附的蛋白分子层决定。基材植入体内后，可从周围体液中选择和摄取某些蛋白组分(如纤连蛋白，层粘连蛋白，玻璃粘连蛋白)，而多种蛋白在材料界面的竞争性吸附和解吸附的最终状态——Vroman效应，则决定了材料表面性质和种子细胞的生物学行为。由此出发，仿生修饰策略旨在通过物理、化学、生物学手段在基质材料-细胞作用界面“重建”具有一定三维结构和分子信号的的微环境，提高种子细胞在材料表面的种植密度、粘附效率和信号强度，诱导特定的细胞信号级联反应，引导细胞向特定组织靶点生长分化。其优势在于其充分认识到细胞外基质(Exracellular Matrix，ECM)在骨发育、维持、愈合及重建中的作用，即ECM微环境与成骨细胞、骨祖细胞的对话和通讯的重要性。

对材料进行表面修饰可以采用具有粘附特性的蛋白或多肽。早期多采用天然蛋白，如FN、胶原、层粘连蛋白，但成本高，可控性低，易引起免疫和交叉反应等因素限制了其使用。后期发现以上蛋白的细胞粘附位点仅由数个氨基酸组成的基序所决定，如位于¹⁰FNIII的RGD基序。多年来的深入研究已经较理想的通过仿生手段实现了FN对组织工程材料的界面改性。其中最先选择，使用最广泛的是含RGD序列的多肽(模拟肽)，如四肽RGDS，六肽GRGDSY，七肽GRGDSPC等。事实上，RGD并非仅存于FN，它是一类存在于多种粘附蛋白结构中的共有基序，如骨唾液蛋白和骨桥蛋白，因此将其修饰到材料表面可通过多种途径提高粘附效率。由此，第一代仿生表面修饰材料应运而生，即将RGD肽通过被动吸附的方法固定至材料表面。实验表明该表面对成骨细胞的粘附和成骨分化具有正向调控作用。如Dee，Bearinger等在体外实验中分别将RGD肽圈定在硼硅玻璃、石英、互穿聚合物网络等材料表面，发现其可增强成骨细胞粘附、增殖、和分化。此外，经RGD肽接合的植入物可更有效的促进植入物周边新生骨形成。Ferris，Kantlenheler等发现该界面上新生骨量面积、厚度等指标均优于空白对照。国内学者郑启新将RGD七肽共价交联至PLGA表面，发现其可更有效的促进间充质干细胞的粘附，细胞骨架再组装和早期成骨标志碱性磷酸酶活性增强。

尽管与天然蛋白相比，RGD肽可控性强，然而由于缺乏附属或调节性结构域存在，使其难以达到天然蛋白的高级结构和空间构象，故其生物活性受限。此外，表面参数如形态、构象、使用密度等，可严重影响RGD序列的功能。如有研究发现环形肽(cyclo-RGDFX)在重建关节软骨时较线性肽(GRGDSPC)具有更长的生物半衰期和更低的基础效应密度。此外尚受使用密度和构象特异性限制，且存在在特定力场作用下脱吸附问题。

为提高提高生物利用度，同时兼顾整合素亚型的特异性(如α5β1)和非RGD位点结合的整合素亚型(如α2β1)的作用，第二代仿生修饰表面的改良策略是在RGD序列周围圈定足够的功能位点，以通过整合素和非整合素受体途径发挥作用。其中方法之一是多种短肽混合修饰，如Rezania等运用RGD和FHRRIKA(肝素结合基序)混合修饰表面可增加成骨细胞黏附和矿化。方法之二是核心基序RGD和辅助序列PHSRN的互补性修饰。如Dillow和Kao等将如上序列偶联或单独修饰于聚乙二醇多聚物表面，发现其与α5β1整合素的耦合强度、与巨噬细胞的粘附均显著增强。

针对第一、二代仿生界面的修饰特点，Garcia等在大量针对FN分子结构和功能学研究的基础上，开发出一种可模拟天然蛋白一级、二级和三级结构的高分子量配基，如FNIII7-10、FNIII9-10。该分子可在原核或真核生物系统内合理修饰、高效表达，理想地模拟了天然蛋白的构象效应，具有与血浆FN相同的生物效应。在促粘、促成骨分化方面具有其他多肽分子无可比拟的优越性。