[发明专利]利用生物酶电极法检测根系分泌物中苹果酸的电化学方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用酶电极检测根系分泌物中苹果酸的方法，属于生化分析领域。

背景技术

根系分泌物是植物生长过程中向根际释放的一类物质。广义的根系分泌物是植物根系释放到根际环境中各种物质的总称，而狭义的根系分泌物是指植物根系通过溢泌作用释放到根际环境中各种可溶性有机物的总称。根系分泌物的种类繁多，目前已鉴定出来的有机化合物有200多种，主要包括有机酸、糖类、氨基酸和酚酸（化感物质）等低分子量的有机物，还包括类似于黏胶和酶之类的高分子量有机物质。在根系分泌物的众多物质中，低分子量有机酸是研究最为广泛也是最为重要的一类物质。根系分泌物中低分子量有机酸主要包括诸如甲酸，乙酸，草酸，苹果酸，丁二酸，马来酸，柠檬酸，富马酸等等。其中苹果酸是根系分泌物中的重要有机酸，在特定的植物中，根系分泌的苹果酸量不仅与根系分泌的有机酸总量有显著的正相关，而且还与草酸、柠檬酸等呈现显著的正相关，因此，测定根系分泌的苹果酸量可以评价某一物种在特定条件下的有机酸分泌情况。

   根系分泌物的成分复杂，目前，常见的测定根系分泌物中的苹果酸的气相色谱法（GC）、离子色谱法（IC）和高效液相色谱法（HPLC）等方法，都需要繁杂的前处理过程，而且常常出现灵敏度低、效果不理想的情况。同时这些方法还存在单个样品分析时间长，色谱柱易污染，分析价格昂贵的缺陷。

生物传感器是一个非常活跃的研究和工程技术领域，它与生物信息学、生物芯片、生物控制论、仿生学、生物计算机等学科一起，处在生命科学和信息科学的交叉区域。生物传感器研究起源于20世纪的60年代，1967年Updike和Hicks把葡萄糖氧化酶(GOD)固定化膜和氧电极组装在一起，首先制成了第一种生物传感器，即葡萄糖酶电极。到80年代生物传感器研究领域已基本形成。其标志性事件是：1985年“生物传感器”国际刊物在英国创刊；1987年生物传感器经典著作在牛津出版社出版；1990年首届世界生物传感器学术大会在新加坡召开，并且确定以后每隔二年召开一次。此后包括酶传感器的生物传感器研究逐渐兴旺起来，从用一种或多种酶作为分子识别元件的传感器，逐渐发展设计出用其他的生物分子作识别元件的传感器。酶传感器的优点有稳定性好，分析精度高、分析成本最低、品种多，应用范围广、分析速度快。要在众多成分共存的根系分泌物中测定苹果酸, 利用苹果酸及其苹果酸脱氢酶的专一性，制作生物传感器进行检测，将提高检测的特异性，同时能达到简便、快速、灵敏的效果。

石墨烯(Graphene),它是2004年由曼彻斯特大学的科斯提亚??诺沃谢夫和安德烈??盖姆小组首先发现的。自发现以来，石墨烯受到了全世界科学家的广泛关注。纯石墨烯是一种只有一个原子厚的结晶体，具有超坚固、超强导电性、优异的电学、热学和力学性能等特性。石墨烯纳米复合物作为一种新型的高性能材料，不仅保持了石墨烯的一系列优良性能，还具有纯石墨烯材料不具有的其它优良性能如催化活性和易分散性等，从而为石墨烯的广泛应用提供了前提条件。由于石墨烯纳米复合物良好的导电性，将其应用于生物传感可提高装置的灵敏度、响应速度和抗干扰能力等一系列性能，这是目前许多材料制作的生物传感器无法比拟的。应用石墨烯纳米复合物作材料制作苹果酸脱氢酶电极，建立酶电极传感器检测根系分泌物中的苹果酸，可达到灵敏度高、检测限低、特异性好、仪器简单便宜、操作简便快速的效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种利用生物酶电极法检测根系分泌物中苹果酸的电化学方法，该方法用石墨烯纳米复合物作为一种新型的高性能材料，修饰电极制备苹果酸脱氢酶电极，直接测定根系分泌物中的苹果酸，以克服其它方法中样品的处理较为复杂，单个样品分析时间长，色谱柱易污染，干扰因素多的缺点。

本发明采取以下技术方案，它包括以下过程：第一，制作苹果酸脱氢酶（MDH）电极；第二，苹果酸脱氢酶电极、饱和甘汞电极和铂丝电极与电化学工作站连接，在焦磷酸钠缓冲体系下研究该电极反应的优化条件；第三，在恒温电磁搅拌下，设置操作电压，待背景电流稳定后，连续加入一定浓度的苹果酸溶液到电解池中，利用恒电位计时电流法，测定不同苹果酸浓度下相应的电流变化值，得到一个催化电流与苹果酸浓度的线性范围，要求在实际检测过程中结果必须在这个线性范围内；第四，加入根系分泌物样品到电解池中，利用恒电位计时电流法，在恒温电磁搅拌下，将电流的增加值作为y轴，纯苹果酸标准溶液加入量作为x轴，绘制标准曲线，依据标准曲线求y=0时的x值，此时x的绝对值就是稀释一定倍数后样品中的苹果酸的浓度。