[发明专利]一种能够催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术与难降解有机污染物生物处理技术领域，特别涉及一种能够催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶。 

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一类含有两个或两个以上苯环的有毒有机污染物，具有强烈的致癌作用、致畸作用和致突变作用。PAHs能通过生物累积及食物链的传递作用对生态环境和人体健康造成极大危害，已引起各国环境科学家的高度重视。美国环保局早在80年代就已把16种未带分支的PAHs确定为环境中的优先污染物，我国也把PAHs列入环境污染的黑名单中。 

目前对环境中多环芳烃的治理技术主要有物理法、化学法和生物法。物理处理技术主要存在处理费用高与去除不彻底的缺点。在化学法中国内外有学者利用有机溶剂(如乙醇、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮)及表面活性剂等洗脱环境中的多环芳烃，但会存在二次污染等问题。生物法具有操作简单、运行费用低、无二次污染等优点。一般来说，随着多环芳烃苯环数量的增加，其降解速率降低。因此，低分子量的多环芳烃在环境中能较快被降解，在环境中存在的时间较短，而高分子量的多环芳烃，例如苯并[a]芘、茚并[1，2，3-cd]芘等则难于降解，较长期存在于环境中。从降解微生物细胞中提取降解酶来强化降解已成为去除多环芳烃污染的一种重要方法。降解酶在多环芳烃降解的应用中具有降解效率高、作用底物浓度低及环境适应性强等优点，具有广阔的应用前景。但是，由于对多环芳烃降解微生物缺乏深入的研究，国内外缺少高环多环芳烃降解酶方面的研究报道。 

发明内容

本发明提供一种能够催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶。所述能够催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶由潘多拉菌Pandoraea sp.的菌液经过提取与纯化得到的。该酶在进行催化降解茚并[1，2，3-cd]芘时，适宜pH值为6.0～8.0，最适宜pH值为7.0，当pH值小于4及大于10时容易失活变性，适宜反应温度为30～45℃，最适宜反应温度为35℃，当温度高于50℃易于失活变性，浓度为1mmol/L的Cu²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺离子对酶的活性有较强抑制作用。 

分离能够催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶所用的菌株潘多拉菌Pandoraea sp.在2010年01月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心位于北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.3615。从潘多拉菌Pandoraea sp.中分离能够催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶具体方案为： 

①向加入198ml诱导培养基、2.0ml微量金属液和0.2ml维生素c溶液的培养瓶内接种保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株潘多拉菌Pandoraea sp.；然后用透气膜密封瓶口，将培养瓶在培养温度为25～28℃、转速为100r/min的振荡器中培养40d后即可得到扩增培养后的菌液； 

②将步骤①中的菌液进行超声波破碎15min；破碎后的菌液在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液； 

③向由步骤②分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min，在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液； 

④向由步骤③分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min，在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液； 

⑤合并由步骤②、③和④所收集的上清液，即可得到酶粗提液； 

⑥向由步骤⑤得到的酶粗提液中加入碾细的(NH₄)₂SO₄固体至65～70％饱和度，在转速为100r/min的振荡器中振荡1～2h，然后在8000r/min条件下离心15min，分离出沉淀； 

⑦将由步骤⑥得到的沉淀溶于少量pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液并装入透析袋中，将透析袋在pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液中透析24h；将透析后的样品在8000r/min条件下离心15min，分离出上清液；