[发明专利]添加抗氧化剂CAT和VE制备家畜性控冷冻精液的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物繁殖技术领域，主要提供通过添加过氧化氢酶(CAT)和维生素E(V_E)，有效保护家畜精子分离、冷冻过程中精子生理机能，提高精子解冻后活力与延长精子存活时间，从而制备能够正常受精受胎的家畜性控冷冻精液的方法。

背景技术

家畜精子分离-性控技术从2000年产业化以来，目前已经在全世界十余个国家推广应用。但是，在实际生产中，与普通家畜冷冻精液相比，由于性控冻精要经过离心、染色、分离过程，造成对性控精子的损伤，影响性控冻精解冻后的活力与存活时间，并导致性控冻精受胎率低下的问题。为了提高性控冻精的品质，研究开发了该性控冻精生产方法。

发明内容

本发明提供了一种添加抗氧化剂CAT和V_E制备家畜性控冷冻精液的方法，该技术原理是利用抗氧化剂CAT和V_E能够抵抗携带有自由基的活性氧族(ROS)特点，在精子分离、冷冻的过程中添加CAT和V_E，降低活性氧族对精子造成的过氧化损伤的作用，从而提高解冻后精子活力和延长精子存活时间，提高性控冻精产品质量达到受精受胎目的。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种添加抗氧化剂CAT和V_E制备家畜性控冷冻精液的方法，它包括以下步骤：

(1)、CAT液和V_E液的配制：

室温下称取4.2mg的CAT加入1ml的蒸馏水中溶解，避光保存在-20℃，保存期限为一周；称取4mg的V_E加入1ml的DMSO中溶解，避光保存在4℃，保存期限为一周；

(2)、家畜原精的抗生素补加：

按照1ml家畜原精添加6μl林可-奇霉素、6μl泰勒霉素、8μl东大霉素的比例在家畜原精中添加抗生素；

(3)、精子分离：

1)将补加好抗生素的家畜原精用50μm精液过滤器过滤至新的离心管中，除去原精液中的杂质，过滤后使用密度仪检测原精实际浓度，置18-20℃冰箱中保存；

2)计算六台分离机用于染色的原精体积数＝六台分离机每小时分离精子总数12亿/原精实际浓度；

3)根据步骤2)计算好的用于染色的原精的体积数，用15ml离心管从步骤1)中取出原精，补加Staining Talp到3ml，360g离心洗涤，5分钟；

4)在另一个新的离心管中按照12亿原精加入75μl Hoechst33342荧光染料、加入6ml Staining Talp的比例，将Hoechst33342荧光染料和StainingTalp进行混合，并用悬浮振荡器轻微振荡3秒，Hoechst33342荧光染料的浓度为5mg/ml；

5)步骤3)离心停止后，吸弃2ml上清液，保留体积1ml，将其转移至上述步骤4)的15ml离心管中，34℃染色45分钟后，加入6ml的4％eggyolk；

6)把步骤5)染色处理的原精按每个分离管2亿原精进行分装，把分装好染色后的原精样品放入分离机的样品台内，分离原精；

7)根据分离机上的读数记录每台分离机的精子分离总数，计算六台分离机的精子分离总数＝每台仪器分离数×6(单位：千万)；

8)从-20℃冰箱中取出的buffer缓冲液中，按照1ml添加5μl CAT液、1μl V_E液的比例，添加抗氧化剂CAT液和V_E液，室温预热半小时，作为分离后精子的回收液，所说的buffer缓冲液含84％的TrisA冷冻平衡液和16％超纯水；分离精子下机后，在4℃条件下平衡90分钟，850g离心20分钟后，弃上清液，将精子沉淀，用悬浮振荡器进行轻微震荡，震荡后将所有分离后的精子都倒入一个空离心管中；

(4)、添加抗氧化剂性控冻精的制备：

1)在Tris-A、Tris-B中添加抗氧化剂，添加比例为：1ml Tris-A分别添加51μl CAT液、1μl V_E液，1ml Tris-B分别添加5μl CAT液、1μl V_E液，添加完抗氧化剂后，将Tris-A、Tris-B分别混合均匀，放在4℃条件下平衡90分钟；