[发明专利]获得青蒿单倍体植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种获得青蒿单倍体植株的方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)为菊科蒿属一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其植株地上部分提取的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前最有效的治疗疟疾的药物。世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法。随着近年来对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家还发现青蒿素及其衍生物具有抗血吸虫、抗炎、抗肿瘤以及免疫调节等功能，是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成青蒿素的难度大，产量低，成本高，不具备可行性。因此，通过传统育种和基因工程育种手段培育青蒿素高产品系具有重要的实际应用价值。

青蒿为严重自交不亲和植物，因此高产植株很难通过自交等传统育种手段在短期内获得纯合品系。通过转基因技术，如过量表达青蒿素合成途径上的关键酶基因亦可以有效提高青蒿素含量，但是这同样面临由于自交不亲和导致的高产性状无法在转基因后代中稳定遗传的难题。

通过花药培养培育单倍体进而通过施用秋水仙素等染色体加倍剂使染色体倍性恢复到正常水平是育种学家经常采用且技术相对较为成熟的手段。该技术自上世纪50年代以来已被广泛地应用于很多植物，包括蔬菜、花卉和粮食作物。

基于青蒿的自交不亲和性，对于性状优良、青蒿素含量高的青蒿植株，通过花药培养培育成单倍体，然后采用染色体加倍剂使单倍体青蒿植株染色体恢复到正常水平进而培育成纯合品系是青蒿育种的一个优良方法，通过该方法可以在较短时间内培育出青蒿素含量高的青蒿纯合品系。然而，到目前为止，国内外还没有关于通过花药培养培育青蒿单倍体植株的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服目前尚无培育青蒿单倍体植株方法的现状，提供一种通过花药培养培育青蒿单倍体植株的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明提供了一种获得青蒿单倍体植株的方法包括如下步骤：

(1)选取青蒿花药中小孢子发育处于单核期的青蒿花蕾；

(2)采集小孢子处于单核晚期的花蕾，消毒后将花药分离出来接种于愈伤诱导培养基上，黑暗培养一段时间后继续见光培养；

(3)将步骤(2)长出的愈伤组织转移至愈伤分化培养基培养至分化出芽；

(4)将分化出芽的健壮小苗转移至生根培养基进行生根培养；

(5)将生根后的茁壮幼嫩青蒿苗移出培养灌，移栽入土；

(6)对步骤(5)获得的花培植株进行倍性鉴定，筛选出单倍体青蒿植株。

优选地，步骤(1)所述小孢子发育时期为单核晚期，即单核靠边期。

优选地，步骤(2)所述花药接种密度为10～50枚/皿，更优选地为30枚/皿。

优选地，步骤(2)所述黑暗培养为25℃下黑暗培养15～50天，更为优选地，为15～30天。

优选地，步骤(2)所述见光培养的条件为：温度为25℃、光照强度为2000lx、光照周期为16/8(光照/黑暗时间比)；所述见光培养的时间为5～15天，更为优选地，为5～10天。

优选地，步骤(2)所述愈伤诱导培养基为MS+6-BA+NAA，其中，6-BA(6-苄氨基嘌呤)浓度优选为0.5～1.5mg/L，更优选地为1.0mg/L；NAA(萘乙酸)浓度优选为0.1～0.8mg/L，更优选地为0.3mg/L。

优选地，步骤(3)所述愈伤分化培养基为MS+6-BA+NAA，其中，6-BA浓度优选为1.0～4.0mg/L，更优选地为4.0mg/L；NAA浓度优选为0.01～0.1mg/L，更优选地为0.05mg/L。

优选地，步骤(4)所述生根培养基为1/2MS+NAA，其中，NAA浓度优选为0～1.0mg/L，更优选地为0.5mg/L。

优选地，步骤(6)所述倍性鉴定方法为流式细胞法。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：首次实现了通过花药培养培育出青蒿花培植株，并从其中鉴定出了单倍体青蒿苗，填补了青蒿单倍体育种领域的技术空白，为青蒿纯系育种平台的构建以及以青蒿单倍体为材料的如单倍体转基因技术等实验的开展奠定了基础。

附图说明

图1为青蒿小孢子发育时期鉴定图；其中，(a)为四分体时期小孢子；(b)为单核期小孢子；