[发明专利]几丁质酶的四膜虫表达载体及其在表达几丁质酶中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种几丁质酶的四膜虫表达载体及其在表达几丁质酶中的应用。

背景技术

几丁质(Chitin)又称甲壳素或壳多糖，是以N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)为单体，通过β-1，4糖苷键连接而成的生物多聚体，是自然界中除纤维素外储量最大的生物多聚糖，每年生物合成量达100亿吨。几丁质至今已陆续在微生物、植物、动物中发现，尤其是在真菌细胞壁、节肢动物外骨骼、甲壳类动物的外壳中，几丁质维系其稳定的结构物质，是绝大部分真菌细胞壁的结构物质，占细胞壁干重的40％-60％。

几丁质具有良好的生物相容性、生物降解性，在生物化工、食品、环保、农药等各种领域中有着广泛的应用前景。几丁质同时也具有抗菌、降胆固醇和抗肿瘤的活性。几丁质及相关材料也被应用于污水处理、药物输送、伤口的治愈以及作日常的膳食纤维。但因为分子量大、晶体结构紧密、不溶于水和普通溶剂，限制了几丁质的应用。目前一般用化学降解的方法来制取几丁质的降解产物，但该方法造成较严重的环境污染，而用几丁质酶降解法能克服这个缺点，而且能控制降解的程度。

广义的几丁质酶是指所有与几丁质降解有关的酶，除了狭义的几丁质酶，还包括脱乙酰酶、壳聚糖酶、几丁寡糖酶、几丁二糖酶等。狭义的几丁质酶是指催化水解至少含有一个N2乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，包括几丁内切酶和几丁外切酶。几丁质酶(Chitinases)广泛的存在于病毒、细菌、真菌、昆虫、高等植物和动物中，并且发挥着作不同的作用。从微生物中分离筛选几丁质酶产生菌的报道最近越来越多，绝大多数的细菌性几丁质酶属于第18家族，其主要功能是分解周围环境中的几丁质，以满足其自身对营养的需求，而对真菌的抑制能力较弱或无。植物产生的几丁质酶大部分为第19族糖基化水解酶类，其功能主要是抑制病原真菌的生长，进行自我防御。

现有的表达系统很多。动物细胞表达系统因成本高，使其应用受到限制。常用的大肠杆菌表达系统和酵母表达系统中，大肠杆菌表达系统虽然具有外源基因表达水平高等优点，但是因其缺乏真核生物转录后加工及翻译后加工等功能，其表达的产物往往活性不高或是无活性等，特别是用其表达真核蛋白时。酵母表达系统与动物细胞一样具有真核生物转录、翻译后的多种加工过程，能够表达出多种具有活性的外源蛋白而备受关注，但也存在着明显的局限，如以酿酒酵母为主体的表达系统中缺乏强有力的启动子、分泌效率差、质粒不稳定、难以达到很高发酵密度、只能分泌少量蛋白、表达的蛋白质容易降解、其翻译后加工与高等真核生物有所不同等。

四膜虫(Tetrahymena)隶属于原生动物亚门、纤毛亚门、寡膜纲、膜口目、四膜科属，是单细胞真核生物。

发明内容

本发明的目的是提供一种几丁质酶的四膜虫表达载体及其在表达几丁质酶中的应用。

本发明提供的DNA片段(几丁质酶的编码基因的表达盒)，自5’至3’方向依次包括HSP70-2基因启动子、几丁质酶的编码基因和HSP70-1基因终止信号；所述HSP70-2基因启动子如序列表的序列1自5’末端第9至1126位核苷酸所示；所述HSP70-1基因终止信号如序列表的序列1自5’末端第3835至4304位核苷酸所示；所述几丁质酶如序列表的序列2所示。四膜虫的HSP70-2基因启动子能高效启动几丁质酶的编码基因(CBD3基因)的表达。

所述几丁质酶的编码基因具体可如序列表的序列1自5’末端第1142至3820位核苷酸所示。

所述DNA片段具体可如序列表的序列1自5’末端第9至4304位核苷酸所示。

含有所述DNA片段的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。