[发明专利]一种快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法

权利要求书

1.一种快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法，其特征在于该方法按以下述步骤进行：

（1）采用标准酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取夜蛾科害虫总DNA；

（2）利用DNA条形码引物扩增线粒体CO1前部序列进行PCR扩增和测序作为标记；

（3）依据害虫的核苷酸的序列特征变异位点进行物种鉴别。

2.根据权利要求1所述的快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法，其特征在于所述步骤（1）中为避免真菌和线虫的污染，舍去腹部，翅部以及触角，只从其头、胸及腿部提取DNA。

3.根据权利要求1所述的快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法，其特征在于所述步骤（2）的PCR反应体系为50μl，其中模板DNA约25ng，1×PCR buffer，2.5mM Mgcl₂，1mM dNTP，2 μg/μl BSA，正、反向引物各2 pM，TaqDNA 聚合酶1个单位；具体操作为，加去离子水调至终体积50μl，以石蜡油封盖体系；PCR反应条件如下：95℃预变性3分钟，94℃ 变性1分钟，50℃ 退火1分钟，72℃延伸1分钟；5个循环后，72℃再延伸10分钟，上电泳测序。

4.根据权利要求1所述的快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法，其特征在于步骤（2）中利用DNA条形码引物为COIF: 5' –ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATA TTG G-3' 和 COIR: 5'-TAA ACT TCT GGA TGT CCA AAA AAT CA-3'。

5.根据权利要求1所述的快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法，其特征在于所述步骤（3）是按下表所示的核苷酸序列特征变异位点进行物种鉴别：

 031040049059070079081085088091127169181190217220238241242斜纹夜蛾AACYTAYAGAATAAATATT棉铃虫ARTTATAYATTAKTACCAA烟青虫TATTATATGTTTTTRCCAA

 262263265266268271274283286289298313319325340346349352364斜纹夜蛾ACTTAATCAATTRTCCCCT棉铃虫RTACTCYTRTAYAACATAA烟青虫ATACTCCTATATAATATAA

 368370385386400401403406407418436439442451467468477478484斜纹夜蛾GTTTCCTCYTTTCTCGATA棉铃虫RAYCTTATTCAYTTAAGCT烟青虫GATTCTATTTATTAAAATT

 496499506536539547553562565578580586595596598601607616619斜纹夜蛾ATGTTTTTATATTTATATR棉铃虫RAAYYAAATCTAYCTTTYT烟青虫RTATTTATACTATCTCTCT

 620622623631634641643646斜纹夜蛾KAKTCCTT棉铃虫GTGTTTAT烟青虫GTGATTAC