[发明专利]一种BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊及其应用，包裹的质粒是分别由绿色和红色荧光蛋白标记的BMP-2(骨形态发生蛋白-2)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，该壳聚糖纳米微囊包裹的BMP-2和bFGF双基因能同时转染入细胞并有效表达。

背景技术

骨缺损常由外伤、感染及肿瘤等疾病引起，会造成严重的人体功能障碍和外貌畸形，给患者工作、生活、社交带来巨大的影响，是临床医学面临的一大难题。目前对骨缺损的治疗主要有自体骨移植修复和各种材料充填两种。前者的主要缺点在于供区损伤和供骨有限；后者的主要缺点在于移植物排斥和成骨性能不良等。当前骨缺损治疗的困境在于：骨缺损治疗仍然以传统方法为主，且效果欠佳；基因治疗骨缺损存在很多问题。这就有必要应用多样的技术，特别是多基因联合治疗的方法，对组织工程化人工骨的构建进行改良和完善。

基因治疗是维持骨缺损局部生长因子有效治疗浓度进而提高疗效最有希望的一种方法。其优点在于：保证基因产物的局部靶向释放；可最大限度地增加局部治疗效果，减少副作用；多种基因可分别转导，并分别调控，内源性合成的蛋白质比外源性重组蛋白具有更强的生物活性。

但是，骨缺损基因治疗目前至少存在以下问题：①研究多集中与单一基因方面，而事实上，在骨折愈合及骨生成过程中，有多个基因共同参与并协同表达；②基因转染多采用病毒为载体，一般只转载一个基因，同时存在免疫原性、安全性等很多问题；③种子细胞来源受限制，骨髓基质细胞等的获取繁琐且难于被患者所接受。

自1965年Urist首先发现骨形态发生蛋白(Bone morphogenticproteins，BMPs)具有骨诱导能力以来，骨的生长和修复受骨诱导因子的调控已被国内外学者所公认。BMPs是唯一一类能够启动成骨分化，并作用于成骨整个过程的细胞因子。BMP-2是第一个在体内实验中证明具有诱骨活性的BMP分子，并且可作为诱骨的充分条件，即在只有单独BMP-2存在的情况下即可诱导软骨和骨组织的形成。在局部使用BMP-2蛋白或转染了BMP-2基因的骨髓基质干细胞用于治疗骨缺损已经获得了一定的成功。

然而，组织工程骨要得到理想的愈合效果，其再血管化是一个十分关键的环节。现已证明碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)是体内最为有效的血管形成因子之一，对新生血管形成过程中多个环节起作用，可刺激毛细血管内皮细胞的迁移和增生，形成毛细血管芽，同时能刺激纤溶酶原激活剂和胶原酶分泌，对创伤区域的细胞外基质进行降解，使毛细血管向创面区域延伸。bFGF也是一种强大的促软骨细胞、骨髓基质干细胞有丝分裂因子，可促进软骨和骨组织的形成。与VEGF(Vascular endothelial growth factor，血管内皮细胞生长因子)相比，BMP-2、bFGF基因修饰(各基因分别单独转染)的种子细胞能够更为有效地在骨组织工程中发挥作用。

Franceschi等用腺病毒分别表达BMP-2、4和7后转染细胞，结果发现联合应用时成骨能力提高。理论上BMP-2和bFGF的协同作用将取得更佳的成骨效果，这就需要去寻找能同时转导多个基因的载体。

目前基因转染多采用病毒为载体，如逆转录病毒、腺病毒等，虽取得一定成功，但一个病毒载体一般只能转载一个目标基因，同时在表达时间、免疫源性反应以及安全性方面仍存在很多问题。据Nature和Scinece和的报道，1999年9月，18岁的美国少年Gelsinger J在腺病毒介导的基因治疗临床研究中不幸死亡。裸露质粒由于转染效率较低而未推广，非病毒载体如阳离子脂质体lipofectamine早在1987年就已研发，随之一些合成聚合物载体如赖氨酸(PLL)、二氯乙基(DEAE)-葡聚糖、磷酸钙和树枝状聚合物等均用于DNA释放，还包括一些控制释放聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVAc)等。

纳米载体分为纳米微囊和纳米颗粒，壳聚糖载体是纳米微囊结构，它将基因包裹在内部，纳米颗粒则将基因结合在颗粒的表面。壳聚糖是由β-1-4键合葡糖胺和一部分N-乙酰基葡糖胺组成的天然线性阳离子多糖，为低毒性且生物相容性基因载体，因而可增加DNA/壳聚糖配合物剂量而提高其转染率。Corsi等采用壳聚糖DNA纳米载体转染人骨髓间充质干细胞、肾肉瘤细胞和人胎肾细胞，发现壳聚糖DNA纳米微囊在基因转运中具有毒性小、细胞型依赖性的特点。