[发明专利]以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型，尤其涉及一种以具有组成型NF-κB活性细胞为基础的药物筛选细胞模型；本发明同时还涉及该药物筛选细胞模型的构建方法和应用。

背景技术

核因子-κB（NF-κB ，nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)是重要的转录因子，主要包括 RelA （p65）、RelB、c-Rel、p50 和 p52，通常 NF-κB 以同源或者异源二聚体的形式存在，其中 p65/p50 二聚体是最常见的 NF-κB 形式。正常情况NF-κB下参与了多种生理反应，如与细胞粘附、分化、凋亡、细胞外基质的降解、炎性细胞趋化、免疫激活等等基因。多种因素可以激活NF-κB而引发下游反应，包括多种细胞因子（如肿瘤坏死因子TNFα及白细胞介素IL-1β等）、应激刺激、LPS（脂多糖）、病毒或其它外源核酸、自由基等等。在经典的通路中，NF-κB二聚体由于结合了其抑制蛋白 IκB（Inhibitor of NF-κB）而大部分滞留在细胞质中，外加刺激或病理情况下（诸如上述诱导因素）由于 IκB 被过量降解而导致 NF-κB 活化入核，行使一系列功能；同时近些年的研究表明NF-κB 二聚体如p65/p50可以在与其它一些蛋白结合的过程中被活化行使功能（如STAT3）。

NF-κB是迄今少数几个研究比较透彻、且公认的在疾病中扮演重要角色的关键分子之一。异常活化的NF-κB活性通常与肿瘤发生、发展及转移，免疫异常诸如关节炎、自身免疫、哮喘、某些心脏病等疾病相关。研究发现，在许多类型的肿瘤中，像乳腺癌、结肠癌、前列腺癌，恶性淋巴瘤细胞等等，都有持续活化的NF-κB活性。研究表明，在这一类肿瘤细胞中，抑制NF-κB活性将有效的降低肿瘤细胞的存活、增殖等过程，有效地降低其恶性程度；因此，抑制NF-κB的活性自然成为减缓和治疗免疫系统疾病的重要方案之一（Wang等人：Science 1996； Wu等人：EMBO J 1996；Wang等人：Nat Med 1999，Yamamoto等人：J Biol Chem 1999；Yamamoto等人：Curr Mol Med 2001；Yamamoto等人：J Clin Invest 2001）。

基于上述原因，一直以来研究者们试图寻找特异性好，副作用低的NF-κB抑制剂，以最终用于临床，缓解和治疗数目庞大的相关患者。然而时至今日理想的产品少之又少，很大程度缘于没有一套高效而简易的筛选方法。基于报告系统的高通量筛选方法虽已经出现并用于实践，并取得了一定成效，但仍然有一些不可克服的缺点，比如需要外源刺激（先用激活剂激活NF-κB，再去筛选抑制剂），这样不仅筛选步骤多，而且筛选成本也较高，尤其是像细胞因子IL-1β和 TNFα等激活剂的使用将大大增高成本；即使像LPS类激活剂使用成本较低，但由于其本身毒性较大，限制了其使用；同时筛选体系每增加一步，会使报告系统的不稳定性增加（额外的操作必然会带来额外的不确定因素）。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型。

本发明的另一目的是提供一种以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法。

本发明还有一个目的，就是提供一种以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型在药物筛选中的应用。

（一）以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型药物筛选细胞模型

本发明以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型，是利用含有NF-κB 特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型NF-kB 的活性细胞为基础，构建成稳定的以NF-κB信号为靶点高通量药物筛选细胞模型。    

 所述NF-κB 的特异性结合序列为 5’-GGGRNNYYCC-3’；其中R为嘌呤，Y 为嘧啶，N 为碱基。

所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有NF-κB 特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。

所述具有组成型NF-κB活性细胞，为一类具有持续活化NF-κB活性的细胞，包括DU145，前列腺癌细胞、HepG2，人肝癌细胞、H1299人肺癌细胞、A549人肺癌细胞、HCT119人结肠癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、MDA-MB-468人乳腺癌细胞或 MDA-MB-231人乳腺癌细胞等等。