[发明专利]以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型，尤其涉及一种以具有组成型STAT3活性细胞为基础的抗肿瘤药物筛选细胞模型；本发明同时还涉及该抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法和应用。

背景技术

信号转导及转录激活因子3（STAT3）作为重要的转录因子在癌症的发生和发展中发挥着重要的的作用，被公认为是癌症相关蛋白。在许多肿瘤细胞中，如结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤细胞、肺癌、头颈部癌等等细胞中，STAT3常常以持续活化的形式存在，STAT3受到上游信号细胞因子刺激或在某些酪氨酸激酶持续活化的状态下，其C端705位酪氨酸被磷酸化而形成二聚体，进而入核调节转录，启动一系列基因的调控，在促进细胞转化、转移、防止凋亡方面发挥多重作用。通常胞外调节STAT3的细胞因子的有IL-6，LIF，OSM，EGF，PDGF，G-CSF等，胞内维持STAT3持续活性的因素来自于上游受体或非受体酪氨酸激酶的持续活化或自身突变。研究表明，抑制STAT3活性将会大大降低多种肿瘤细胞的生长、生存和转移，从而大大降低它们恶性程度（Ni等人：Cancer Res  2000； Leong等人：Proc Natl Acad Sci 2003； Barton等人： Mol Cancer Ther 2004； Kortylewski等人： Nat Med 2005； Xin等人：Cancer Res 2009）。此外研究表明，在不少肿瘤细胞中，STAT3可以促进和维持NF-κB的活性，而NF-κB则是肿瘤发生和转移的另一重要促成因素，在这一类肿瘤中抑制STAT3活性，不仅抑制了STAT3本身调控的肿瘤相关基因，也在一定程度上下调NF-κB的活性，达到一点双靶的目的（Yang J等人：Cancer Res 2005； Yang J等人：Genes & Dev 2007； Torres J等人： Nat Cell Biol 2008；Lee H等人：Cancer Cell 2009；Yu H等人：Nat Rev Cancer 2009）。

目前基于STAT3为靶点的药物筛选系统通常具有效率低下、步骤繁琐等缺点，例如每次筛药都需要使用外源细胞因子例如白细胞介素6（IL-6）和白细胞抑制因子（LIF）激活细胞内STAT3，额外的步骤将使筛药系统的稳定性大大降低，成本也因IL-6或LIF的使用将大大增加。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型。

本发明的另一目的是提供一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法。

本发明还有一个目的，就是提供一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型在抗肿瘤药物筛选中的应用。

（一）以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型

本发明以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型，是利用含有STAT3特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型STAT3活性细胞为基础，构建成稳定的以STAT3信号为靶点高通量抗肿瘤药物筛选细胞模型。

所述STAT3的特异性结合序列为 5’-TT(C/A)CNNNAA-3’，N为碱基。

所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有STAT3 特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。

所述具有组成型STAT3活性细胞为：DU145前列腺癌细胞、H1299人肺癌细胞、A549人肺癌细胞、HCT119人结肠癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、MDA-MB-468人乳腺癌细胞或 MDA-MB-231人乳腺癌细胞等等。

（二）以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建。

本发明以STAT3为靶点的药物筛选细胞模型的构建，包括以下工艺步骤：

（1）报告系统载体构建：利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有STAT3特异性结合序列以及3’端含有 TATA 盒序列的 DNA 片段，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体。插入序列位于荧光素酶报告基因的上游，当STAT3活化时，便可增强荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译，从而增强了荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时即可检测到更强的荧光；抑制STAT3活性时，荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译的水平都降低，也就抑制细胞内荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时荧光强度也就减弱。