[发明专利]旋毛虫与肿瘤相关蛋白基因制备方法和医用用途

说明书

技术领域

 本发明提供了旋毛虫与肿瘤相关蛋白基因及其制备方法，本发明还提供了该蛋白的医用用途，属于生物制药领域。

背景技术

旋毛虫是一种寄生于人和多种动物体内的线虫，近年来研究发现其具有较强的抗肿瘤活性，但对其抗肿瘤活性成分尚不清楚。据报导恶性肿瘤细胞对异体鉴识物比较敏感，异体抗原物所产生的免疫细胞对恶性肿瘤具有抵抗力。旋毛虫与肿瘤细胞相关基因蛋白能产生针对肿瘤强的特异性和非特异性免疫反应。

发明内容

本发明提供了旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因，为一种新的蛋白基因物质，具有生物活性。

本发明还提供了该相关基因蛋白的制备方法，适用于工业化生产。

本发明进一步公开了该蛋白的医用用途，用于制备治疗肿瘤的药物。

本发明公开的旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因，如SEQ ID NO.1所示。具有以下表征：

本基因蛋白是通过利用抗SP2/0高免血清对旋毛虫cDNA文库进行免疫筛选获得的，对阳性克隆进行扩增，得到全序列长有569bp，含有411bp的开放性阅读框，起始密码子ATG，终止密码子TGA，将其ORF命名为TS411。编码136个氨基酸。

推测它的分子量（MW）为15.6 KD。根据滴定曲线推测其等电点（pI ：Isolectric Point）为10.56。测序结果经登陆NCBI BLAST核酸同源性检索为旋毛虫基因,与旋毛虫核糖体蛋白S24基因的同源性为99%。ORF中有两个碱基存在差异，分别是地135位的C-A，第327位达到A-G，对应的氨基酸有一位存在差异，即45位的Asp-Glu，第109位是同义突变。应用DNAStar软件对TS411蛋白的抗原表位进行预测，发现其存在六个潜在的抗原表位位点。

本发明相关蛋白基因的制备方法如下：

利用酶联免疫吸附试验确定肿瘤细胞抗原与旋毛虫阳性血清、旋毛虫抗原与肿瘤细胞阳性血清间存在相关抗原；利用SP2/0  高免血清对旋毛虫cDNA表达文库进行筛选，得到本相关蛋白基因。

下述的药理实验证实了本发明蛋白基因具有显著的抑制肿瘤生长的作用，可以作为制备抗肿瘤药物被应用。

旋毛虫与肿瘤相关蛋白基因抗肿瘤效果

将18～22g的BalB/C小鼠随机分为TS411原核表达蛋白肌肉免疫组、TS411原核表达蛋白腹腔免疫组、TS411真核质粒免疫组、PBS对照组，免疫佐剂对照组，pVAX-1质粒对照组，每组10只。分别将原核表达的相关抗原200μg（2μg/μL）与等量的弗氏完全佐剂乳化均匀，肌肉/腹腔免疫。将真核质粒100μg（1μg/μL）与等量的司本甘油佐剂均匀混合，肌肉注射。两周后，分别以200μg(2μg/μL)加入等体积的弗氏不完全佐剂进行第二次肌肉/腹腔免疫。将真核质粒100μg（1μg/μL）与等量的司本甘油佐剂均匀混合，肌肉注射。各照组则与实验组平行进行首免和第二次免疫。按分组情况，第二次免疫后三天于每只小鼠的右后肢皮下注射接种1×10⁶个SP2/0细胞。荷瘤30d后，颈椎脱臼处死各个实验组小鼠，并进行肿瘤体积、重量等物理指标的测定以及CD3⁺、CD4⁺ 、CD8⁺、CD19⁺等免疫指标的检测。所有结果数据均利用SPSS 14.0 for Windows 软件进行分析，检验差异显著性。

抗肿瘤试验结果： 

结果表明

TS411基因真核质粒免疫组、TS411基因原核表达蛋白腹腔免疫组、TS411基因原核表达蛋白肌肉免疫组的体内平均抑瘤率分别为：28.3%，24.7%，21.3%。接种相关蛋白基因实验组的瘤重显著低于空白对照组（P<0.01）,各组蛋白基因的抗肿瘤情况见表1）。方差分析结果表明各组瘤重有显著差异。组间检验结果显示，不同免疫途径的抑瘤率没有显著差异。

表1 相关蛋白基因对SP2/0骨髓瘤细胞荷瘤小鼠肿瘤重量和肿瘤体积的影响(                                               ±s,n=10)