[发明专利]四氢嘧啶合成酶基因、重组载体、重组工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及涉及一种四氢嘧啶合成酶基因、重组载体、重组工程菌及其应用，属于酶的基因工程领域。

背景技术

四氢嘧啶作为相容性溶质于1985年在极端嗜盐菌Ectothiorhodospirahalochloris中被Galinski等所发现并且鉴定结构，1988年Inbar等又在革兰氏阳性土壤细菌Streptomycesparvulus中发现了四氢嘧啶的羟基化衍生物羟基化四氢嘧啶。四氢嘧啶类相容性溶质(ectoines,Ecs)是嗜盐菌中最普遍存在的相容性溶质之一，能够为处于外界高温、冷冻、射线、干燥等极端条件刺激下的细胞、蛋白质、细胞膜、和核酸提供保护作用，因此受到各国研究者的广泛关注。此外Ecs对阿尔兹海默氏症、帕金森病等神经性疾病均有一定的疗效，并且最新研究发现Ecs能够提高皮肤的再生能力和延缓皮肤的老化。因此，Ecs在精细化工、生物医药及生物制造等行业将具有广泛的应用前景。

目前处理高盐废水常用的是物化法+生化法的水处理工艺，该工艺流程繁琐，工艺参数要求严格，操作困难，处理效率低，运行成本高，废水处理过程中产生大量有毒有害固废很难处理。经过该工艺处理后的废水很难达到国家的直排标准。据现有报道来看，对高盐废水直接采用生物法处理，在企业的实际应用中少有成功案例。生物法处理虽然在工艺流程以及成本投入方面有很大优势，但由于此种废水的高盐以及极强的杀菌抑制能力，使得其对微生物的杀伤力极大，因此，寻找一种能应用于工业生产的处理高盐废水的微生物是目前高盐废水处理行业所关注的焦点。

近几年，国内外学者对微生物四氢嘧啶合成酶的基因工程研究做了大量工作，并取得了很多重要成果。斯图加特大学根据ES的基因序列、蛋白质结构等的研究情况整理了一个ES酶工程数据库对ES酶相关信息进行了不同的分类。目前为止已克隆了包括微生物和动植物在内的众多ES酶基因，在NCBI中已报道的ES酶基因已达1000余个(包括假单胞菌、酵母菌、葡萄球菌、链霉菌和枯草杆菌等众多微生物来源的)；而且仍在迅猛增加。

由于ES酶基因氨基酸序列具有较低相似性，即不同种甚至同种不同属的微生物之间的ES酶基因序列也存在较大的差异，所以ES酶基因的克隆存在较大难度。目前关于ES酶基因的克隆策略有以下几种：(1)通过构建DNA/mRNA文库克隆ES酶基因：直接将待克隆基因的基因组酶切后回收带有ES酶的基因片段，转化到E.coli中构建基因组文库，在罗丹明B平板上筛选阳性克隆。(2)RACE的方法。分别通过3′RACE和5′RACE，经过两轮PCR，获得基因全长；(3)直接从已知序列设计引物PCR克隆ES酶基因：根据序列同源性比较，参考已报道出发菌株ES酶基因序列设计引物，以基因组DNA为模板直接进行PCR扩增目的ES酶基因片段。

发明内容

本发明的目的是提供一种四氢嘧啶合成酶基因、含有该基因的重组载体和重组工程菌。

本发明的另一个目的是提供该重组工程菌的应用，本发明所述基因为耐盐基因，将该基因转入菌株制得的工程菌耐盐性大大提高，在处理高盐废水中具有重要应用。

本发明是通过以下措施实现的：

一种四氢嘧啶合成酶基因，具有SEQ NO：1所示的核苷酸序列。

本发明四氢嘧啶合成酶基因的得到方法与常规方法略有不同，以前期筛选到的耐盐菌株芽孢杆菌(Bacillaceae)基因组为模板，通过简并引物PCR与反向PCR(IPCR)相结合的方法，扩增得到了编码完整的ES酶基因的ORF框，该基因全长414bp，编码137个氨基酸，序列如SEQ NO：1所示。具体方法如下：

1、根据四氢嘧啶合成酶的氨基酸序列，设计简并引物序列

上游引物  5’-GGNTTYWSNTTYCAYATHACN-3’

下游引物  5’-NGGRTTRAANACRCA-3’

2、以芽孢杆菌(Bacillaceae)基因组为模板，进行PCR扩增获取ES酶基因，其反应体系为：

10× buffer                            5.0 ML 

dNTPs(2.5 mM)                       4.0 μL

上游引物(50 mM)                     1.0 μL

下游引物(50 mM)                     1.0 μL 

Taq DNA polymerase                   0.5 μL