[发明专利]一种紫贻贝G型溶菌酶基因及其重组蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明涉及溶菌酶，具体的说是一种紫贻贝G型溶菌酶基因及其重组蛋白和应用。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme，EC 3.2.1.17)是无脊椎动物体内非常重要的非特异免疫因子之一，它主要通过切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，使细胞胀裂从而引起细菌裂解。溶菌酶在机体免疫应答过程中不仅能直接杀死细菌，还可诱导调节其他免疫因子的合成与分泌。溶菌酶按照其来源分为六类：C(chicken)型，G(goose)型，I(invertebrate)型，植物型，细菌型和T4噬菌体型溶菌酶。动物界的溶菌酶包括前三种类型。C型溶菌酶大都来自于脊椎动物和节肢动物；G型溶菌酶主要存在于哺乳动物、鸟类和鱼类中；而I型溶菌酶只存在于无脊椎动物中。溶菌酶的主要功能是抗菌作用，早期研究发现多数C型溶菌酶通常只能溶解革兰氏阳性菌。最近研究发现，美洲牡蛎和文蛤I型溶菌酶，以及栉孔扇贝、牙鲆、大黄鱼、斜带石斑鱼和大菱鲆G型溶菌酶都具有溶解革兰氏阴性菌的功能。由于G型溶菌酶对各种病原菌具有较好的抗菌作用，在较低温度活性较高且具有较强的热稳定性，因此在开发作为水产饲料添加剂和水产品保鲜剂方面具有很好的应用前景。在海洋贝类中，仅在海湾扇贝和栉孔扇贝体内发现了G型溶菌酶，并进行了较为系统的研究。目前国内外关于紫贻贝G型溶菌酶及其抗菌活性的研究较少。

发明内容

本发明目的在于提供一种紫贻贝G型溶菌酶基因及其重组蛋白和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种紫贻贝G型溶菌酶基因，G型溶菌酶基因如序列表SEQ ID NO.1中的碱基序列所示。

紫贻贝G型溶菌酶基因编码蛋白，G型溶菌酶基因编码蛋白如序列表SEQ ID NO.2中的氨基酸序列所示。

紫贻贝G型溶菌酶基因重组蛋白的应用，所述G型溶菌酶基因重组表达产物可制备为抗菌药物、水产品保鲜剂或水产饲料添加剂。

所述G型溶菌酶基因重组表达产物可作为制备革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抑菌药物。紫贻贝重组溶菌酶对革兰氏阳性菌为巴氏葡萄球菌或金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌或副溶血弧菌。所述G型溶菌酶基因重组表达产物可作为制备恶臭假单胞菌的抑菌药物。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明紫贻贝G型溶菌酶，包括从感染病菌的紫贻贝中提取总RNA、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、G型溶菌酶基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤得到该G型溶菌酶，该G型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；该G型溶菌酶属于一类新颖的紫贻贝溶菌酶，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为食品保鲜剂、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值；该G型溶菌酶的制备方法，通过总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、G型溶菌酶基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤，能得到纯度较高的重组紫贻贝G型溶菌酶。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明还提供了紫贻贝G型溶菌酶的制备方法和应用，该制备方法能得到纯度较高的重组紫贻贝G型溶菌酶，具体可以在开发食品保鲜剂和饲料添加剂中得到应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：紫贻贝G型溶菌酶，包括从感染病菌的紫贻贝提取总RNA、mRNA纯化、cDNA模板制备、G型溶菌酶基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤得到该G型溶菌酶，该G型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

紫贻贝G型溶菌酶的制备方法，包括下述步骤：

1)总RNA提取：用Trizol试剂从感染鳗弧菌的紫贻贝血淋巴中提取总RNA，存于-80℃备用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行；

2)mRNA纯化：用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA；纯化方法依据QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行；