[发明专利]一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法

权利要求书

1.一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）以杂交瘤细胞总mRNA为模板，Oligo dT为引物，反转录合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，在通用引物中筛选适当引物组，扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区基因；所述杂交瘤为能够分泌抗目标抗原的单克隆抗体的杂交瘤；

（2）步骤（1）得到的序列选择大小在300~500bp范围内，条带清晰单一的进行测序，序列输入IMGT数据库进行分析，排除来源于构成杂交瘤的融合伴侣瘤自身的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因；

（3）将候选重链和轻链可变区基因翻译成氨基酸序列后进行三维结构同源模建，获得单链抗体的三维模拟结构，将该三维模拟结构与相应目标抗原分子进行分子对接分析，选出分析结果正确的候选重链和轻链可变区基因；

（4）将分子对接分析结果正确的候选重链和轻链可变区基因通过重叠延伸PCR法拼接成单链抗体基因，进行表达及抗体活性鉴定，最终得到目的单链抗体。

2.根据权利要求1所述基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法，其特征在于步骤（1）所述在通用引物中筛选适当引物的方法为：先确定上游引物序列：将通用引物的上、下游引物分成两组，将下游引物组的所有引物等比例混合，混合物分别与上游引物组的每一条引物混合，扩增目标单链抗体的可变区基因，筛选出能够扩增出基因的引物组，确定出该组的上游引物序列；将确定出具体序列的上游引物再分别与下游引物组中的每一条引物组合，扩增目标单链抗体的可变区基因，筛选出能够扩增出基因的引物组，确定出该组的下游引物序列；依次类推，继续确定出其他引物组序列，完成筛选。

3.根据权利要求1所述基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法，其特征在于步骤（3）所述三维结构同源模建是在RosettaAntibody: F_V Homology Modeling Server平台进行的。

4.根据权利要求1所述单链抗体的制备方法，其特征在于步骤（4）所述表达为酶融合可溶性表达，即将单链抗体基因插入到融合碱性磷酸酶蛋白基因的可溶性表达载体，进行表达。

5.权利要求1~4任意一项所述基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法在制备抗莱克多巴胺单链抗体、抗呋喃它酮代谢物单链抗体、抗有机磷单链抗体和/或抗克伦特罗单链抗体中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备抗莱克多巴胺单链抗体的杂交瘤细胞为AC2，步骤（4）中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:1~2所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:3~4所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ ID NO:1和4。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备抗呋喃它酮代谢物单链抗体的杂交瘤细胞为2BE，步骤（4）中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:5~6所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:7~8所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ ID NO:5和8。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备抗有机磷单链抗体的杂交瘤细胞为12C2，步骤（4）中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:9~10所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:11~12所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ ID NO:9和12。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备抗克伦特罗单链抗体的杂交瘤细胞为5D1，步骤（4）中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:13~14所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:15~16所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ ID NO:13和16。