[发明专利]一种产2,3-丁二酮工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产2，3-丁二酮工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明还涉及一种产2，3-丁二酮工程菌的应用，特别是发酵生产2，3-丁二酮，属于发酵工程领域。 

背景技术

2，3-丁二酮俗称双乙酰，经稀释后呈强烈奶油香味，我国GB2760-86规定其为允许使用的食用香料，主要用于配制奶油、干酪发酵风味和咖啡等型香精。与化学合成法和天然物提取法相比，微生物发酵法生产香料具有产品风味醇厚、柔和、安全性高，生产成本低廉、环境友好等优势。能够代谢产生2，3-丁二酮的微生物较多，典型的菌株有乳品工业中应用广泛的乳杆菌、明串珠菌及乳酸乳球菌属双乙酰亚种，但产量均不高，只能赋予乳制品奶油香味，无法大规模的提纯、制备单体香料。 

微生物中，2，3-丁二酮代谢于支链氨基酸合成途径中间产物乙酰乳酸的非酶氧化脱羧。因此，其前体物质乙酰乳酸的积累是菌体过量合成2，3-丁二酮的关键，可通过弱化或阻断丙酮酸流入乳酸、乙酸、乙醇及TCA循环等代谢途径，强化丙酮酸至乙酰乳酸途径的代谢通量的方法来促进乙酰乳酸的积累，达到微生物高产2，3-丁二酮的目的。 

丙酮酸作为合成2，3-丁二酮的关键前体物质，其在胞内高效合成与积累是获得高产量2，3-丁二酮的前提条件。作为丙酮酸的生产菌株光滑球拟酵母CCTCCM 202019，通过高渗环境的筛选、NTG等诱变育种、维生素营养缺陷型选育以及基于代谢网络提高糖质底物消耗速率和解除丙酮酸底物抑制等策略，实现了丙酮酸高产量、高产率和高积累相统一的目标。因此，光滑球拟酵母CCTCCM 202019可作为2，3-丁二酮的潜在生产菌株。 

发明内容

针对上述现有菌株中，2，3-丁二酮产量低、提取复杂，难以大规模生产的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种产2，3-丁二酮工程菌。 

本发明是基于2，3-丁二酮的高产策略及光滑球拟酵母能够大量积累丙酮酸的优势，将编码乙酰乳酸合成酶的基因在光滑球拟酵母中表达，提高胞内乙酰乳酸合成酶酶活性，促进丙酮酸向乙酰乳酸支路的代谢，实现2，3-丁二酮的积累。 

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种上述产2，3-丁二酮工程菌的构建方法。 

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为： 

1)利用PCR从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中扩增克隆乙酰乳酸合成酶基因(alsS，1713bp) 

2)将扩增得到的alsS与酵母表达载体pYX212酶切、纯化连接，连接产物转化到E.coli JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子 

3)提取质粒、酶切验证，得到重组表达载体pYX212-alsS 

4)将构建好的质粒采用电转化法导入受体菌当中，涂布Ura缺陷平板 

5)验证所述工程菌 

步骤4)中所述受体菌为光滑球拟酵母CCTCC M202019的尿嘧啶缺陷型Torulopsisglabrata Δura3。 

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种所述产2，3-丁二酮工程菌在发酵生产2，3-丁二酮中的应用。 

发酵生产丙酸的工艺为：30℃、200r/min基本培养基摇瓶培养所述工程菌至对数中期，以10％接种量接种入摇瓶发酵培养基，初始pH 5.5，30℃、200r/min发酵72h收集上清液，分析2，3-丁二酮等含量。 

附图说明

图1表达质粒pYX212-alsS物理图谱及其酶切验证、Torulopsis glabrata FMME 055转化子的PCR验证 

A：pYX212-alsS物理图谱 

B：pYX212-alsS的酶切验证，M：Marker，1：pYX212-alsS经酶切后产物，2：pYX212经酶切后产物C：Torulopsis glabrata FMME 055转化子菌落PCR验证，M：Marker，1：Torulopsis glabrata FMME 055，2：Torulopsis glabrata Δura3 

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。 

实施例1  产2，3-丁二酮工程菌的构建 

1.表达载体pYX212-alsS的构建