[发明专利]相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分析方法，具体而言，本发明涉及一种相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法。

背景技术

随着2000年6月国际人类基因组计划的完成，人类开始从基因组时代步入后基因组时代，在后基因组时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，基因的功能是靠其功能的执行者-蛋白质来实施的，因而对蛋白质的表达量、定位、修饰状态以及蛋白质之间相互作用的研究成为后基因组时代的热点研究领域。

在生命体内，蛋白质在发挥功能之前需要经过基因的转录、翻译、翻译后修饰过程，并转运到细胞或组织内特定的部位发挥功能。大多数蛋白质在发生翻译后修饰之前是没有活性的，也就是说，蛋白质的翻译后修饰对于执行蛋白质特定的功能是极其重要的，它使特定蛋白质的结构更加复杂、功能更加完备、调控机制也更加精细。目前在真核细胞中存在20多种翻译后修饰的形式，比较常见的有磷酸化修饰、糖基化修饰、乙酰化修饰、甲基化修饰等。

磷酸化修饰是一种广泛存在于生命体内的蛋白质翻译后修饰，细胞内许多具有关键功能的蛋白质都会发生磷酸化修饰，它参与和调控生物体内的许多生命活动。在真核细胞内，磷酸化修饰主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等氨基酸残基上，人类蛋白质组中含有10万多个潜在的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，对细胞内的各种活性调控均发挥着重要的作用。随着蛋白质组学的飞速发展，对蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。由于磷酸化蛋白质是各种磷酸化形式的复合物，而且是动态变化的，对磷酸化蛋白质组的定量研究突显出尤为重要的意义。

目前，采用相对定量蛋白质磷酸化修饰的方法来表征蛋白质磷酸化水平的变化，一直以来，蛋白质组学面临的一个重要任务就是不同样本中蛋白质的相对定量问题。具体而言，相对定量蛋白质磷酸化修饰方法是一种比较不同条件下蛋白质各个修饰位点上磷酸化水平的相对差异的方法。定量分析的前提是检测蛋白质的磷酸化，所依赖的常规技术是³²P放射性同位素标记法和磷酸化抗体的免疫印迹技术。

检测磷酸化蛋白最经典的生化方法是³²P放射性标记法，可以对活体细胞或者纯化好的蛋白质进行标记。以标记活细胞为例，具体过程为：培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，此时用不含磷酸盐标记的培养液(如DMEM)替换原来的细胞培养液，并加入³²P标记的磷酸盐共培养，使细胞ATP库与³²P平衡，蛋白激酶利用被放射性标记的ATP使底物磷酸化，而后裂解细胞提取蛋白质，随后进行凝胶电泳分离蛋白质混合物，使用³²P的放射自显影信号检测磷酸化蛋白质。

磷酸化抗体的免疫印迹技术是使用抗磷酸化蛋白的抗体特异性得识别电泳凝胶上的蛋白条带，并通过显色反应来检测与抗体结合的磷酸化蛋白。目前，抗酪氨酸磷酸化与抗丝氨酸/苏氨酸磷酸化的抗体(广谱性抗体)是应用较广泛的抗体，理论上它们能够识别和结合多种蛋白质上带磷酸根的特定氨基酸残基。对于组成非常复杂的蛋白质组样品(例如全细胞的蛋白提取液)，通常先使用针对目标蛋白质的抗体首先对该蛋白进行免疫沉淀，而后使用抗磷酸化蛋白的抗体检测目标蛋白上的磷酸化信号。某些情况下，也可使用针对特定蛋白质磷酸化基团制作的抗体来检测该蛋白的磷酸化信号。磷酸化抗体产生的信号的强弱反映出目标蛋白质的磷酸化水平的高低。

但³²P放射性同位素标记法和磷酸化抗体的免疫印迹技术多数情况下只能检测蛋白质整体的磷酸化水平，无法分辨修饰的位点，也就难以对每个位点的修饰水平加以定量。

磷酸化抗体的免疫印迹技术的缺点如下：首先，检测蛋白质磷酸化的广谱性抗体的选择性很低，无法区分是何种蛋白质带有修饰，因此只能用于检测纯化或富集后的单一蛋白质的磷酸化，难以直接分析组成复杂的蛋白质混合物；其次，广谱性的抗体检测的是蛋白质整体的磷酸化水平，难以辨别不同位点的修饰差异，再次，这类广谱性的抗体亲和力也较弱，导致磷酸化比例低的蛋白无法被检测到。因此，免疫印迹只可用于半定量分析，定量的准确性和动态范围都很有限。