[发明专利]苄嘧磺隆通用半抗原、人工抗原及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测及生物化工技术领域，涉及一种苄嘧磺隆通用半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术

磺隆类除草剂是目前世界上最大一类除草剂，自从杜邦公司1982年首次开发出麦田除草剂氯磺隆以后，通过在磺酰脲两端及脲桥上进行修饰等衍生化方法，目前已有近40个品种商品化。磺隆类除草剂通过抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)/乙酸羟酸合成酶(AHAS)，从而破坏蛋白质合成、干扰DNA合成和细胞分裂与生长，是杂草正常生长受到破坏而死亡^[1]。它因高效、用量少、毒性低及半衰时间短而广泛应用于水稻、小麦、玉米等大田作物及花生、马铃薯等瓜果蔬菜^[2]。但是磺隆类化合物因不易挥发、不易光解、有机吸附系数低、随土壤pH上升半衰期延长的特点，造成对当地农作物及环境的危害和损失事件频繁报道及公众环保和健康意识的提高也迫使我们要加强对其残留的监测研究。欧盟已经对饮用水和果蔬中做出最低限量标准为0.05ppm。

传统的磺隆类除草剂残留检测方法有气相色谱、液相色谱和毛细管电泳等方法。气相色谱法由于酰脲类挥发性低和热不稳定需要衍生化；液相色谱配合质谱及固相微萃取等方法虽能对样品中磺酰脲类除草剂进行灵敏准确检测，国内外已有大量文献研究报道，但有毒试剂应用且分析成本高昂；Menne H J等用毛细管电泳方法对土壤样品中磺隆类除草剂进行分析研究发现，由于进样量小，提取液需要高浓度浓缩，从而限制了毛细管电泳在毒物分析中的应用(GARCIA F，HENION J.Fast capillary electrophoresis-ion spray mass spectrometric determination of sulfonylureas[J].J Chromatogr A，1992，606(2)：237-247；MENNE H J，JANOWITZ K，BERGER B M.Comparison of capillary electrophoresis and liquid chromatography for determination of sulfonylurea herbicides in soil[J].J AOAC Int，1999，82(6)：1534-1540)。免疫学检测法，其原理是在成功制备苄嘧磺隆人工抗原的基础上，利用间接酶联免疫检测法(ELISA)来检测样品中苄嘧磺隆的含量，该方法具有灵敏度高、操作简洁快速，无需精密仪器和专业人员在场等优点，在农残的分析检测中发展快速，近来也有磺隆类农残的ELISA分析的文献和专利研究报道(KELLEY M M，ZAHNOW E W，PETERSEN W C，TOY S T.Chlorsulfuron determination in soil extracts by enzyme immunoassay[J].J Agric Food Chem，1985，33(5)：962-965；ZHAO J，YI G X，HE S P，et al.Development of monoclonal antibody-based enzyme linked immunosorbent assay for the herbicide chlorimuron-ethyl[J].J Agric Food Chem，2006，54(14)：4948-4953；SCHLAEPPI D，RAMSTEINER D.Immunological detection of triasulfuron：European，WO/1988/009798A[P].1997-01-15)。

酶联免疫方法的关键点是制备具有免疫原性的人工抗原，高效价抗原的制备是得到特异性抗体及保证免疫检测灵敏性的重要前提，其中半抗原的制备又是抗原制备的关键。苄嘧磺隆因分子量小而不具有免疫原性(分子量小于1000)，不能在动物体内产生抗体，必须与大分子载体偶联制备人工抗原，才能诱导特异性抗体的产生。为此，必须设法先将苄嘧磺隆分子与载体蛋白质共价偶联苄嘧磺隆人工抗原。现有合成的苄嘧磺隆人工抗原保留了苄嘧磺隆的全部分子结构(苯环部分、杂环部分和脲桥部分)，如200910234686.X的发明专利中的记载，其免疫制备而得的抗体仅仅能识别一种苄嘧磺隆分子。