[发明专利]一种人工假病毒的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种核酸制备技术，特别涉及一种人工假病毒的制备方法。

技术领域：

人工假病毒是将目的RNA病毒基因的特定片断克隆至含有噬菌体基因的表达载体上通过诱导表达产生被噬菌体衣壳蛋白包被的RNA片断。人工假病毒可用于核酸检测试剂的阳性对照或核酸标准物质，具有特异性强，灵敏度高，稳定性强的特点。

现有的人工假病毒是从病毒里面提取RNA，以RNA为模板通过PCR方法获得片段，用该片段构建假病毒的表达质粒。用这个表达质粒转染原核细胞后诱导其表达蛋白，对蛋白进行提取纯化即能得到假病毒。现有技术在制备人工假病毒方面存在诸多缺点。本发明经过研究，提出了一种新的人工假病毒的制备工艺，克服了现有技术的缺陷。

发明内容：

本发明提供一种人工假病毒的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，核酸提取：

步骤2，PCR扩增

步骤3，凝胶回收PCR片段

步骤4，限制性酶消化片段、载体

步骤5，凝胶回收酶切产物

步骤6，连接反应

步骤7，转化连接产物

步骤8，质粒提取

步骤9，酶切筛选连接阳性

步骤10，诱导提取人工假病毒

其中

步骤1核酸提取，步骤如下：

1)样本裂解及核酸吸附：

在1.5ml无核酸酶的离心管中加入10μl助沉剂和400μl裂解液，加入200μl待病毒培养物，剧烈震荡2分钟，室温静置10分钟；

加入480μl无水乙醇，颠倒混匀，吸取600μl裂解混合物转移到核酸吸附柱中；

3500g离心2分钟，取下套管，倒掉套管中的液体。将剩余裂解混合物转移至核酸吸附柱，重新离心一次，弃套管中的液体；

将核酸吸附柱重新装入套管，6000g离心1分钟，倒掉套管中的液体；

其中，所述病毒培养物为肠道病毒各亚型病毒培养物；其来源如下：病毒培养物由国家CDC病毒病所提供，采用常用的鸡胚培养法。

如病毒培养物体积小于或大于200μl，需按比例改变助沉剂、裂解液以及无水乙醇体积。体积大于400μl样本应分多次进行处理；有关试剂的准备如下：分别在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml无水乙醇，颠倒充分混匀，并在瓶身上加以标识；

吸取所需的洗脱液，加至一无核酸酶的eppendorf管中，于70℃预热；

冷冻样本应室温融化，轻微震荡混匀后使用；

助沉剂在低温保存时可能呈胶状，吹打混匀即可使用。

2)核酸纯化：

将核酸吸附柱重新装入套管，在核酸吸附柱中加入500μl洗液A，6000g离心1分钟，将核酸吸附柱装入一个干净套管中；

在核酸吸附柱中加入500μl洗液B，静置1分钟，6000g离心1分钟；

倒掉套管中的液体，将核酸吸附柱重新装入套管；

在核酸吸附柱中加入500μl洗液B，6000g离心1分钟。；

将核酸吸附柱换一新套管，13000rpm离心3分钟。

3)核酸洗脱：

将核酸吸附柱装入一无核酸酶1.5ml离心管，小心在吸附膜中央加入50μl预热洗脱液，室温静置4分钟；

10000rpm离心2分钟，离心管中液体即样本RNA。该样本RNA作为下一步扩增的模板。

其中

步骤2.PCR扩增，步骤如下：

1)反应体系：

在0.2mlPCR管中依次加入2*PCR buffer 12.5ul，DNA聚合酶1ul，逆转录酶0.35ul，上游引物0.2uM，下游引物0.2uM，模板RNA 5ul，补水至总体积25ul，充分震荡混匀。放入PCR仪中，进行PCR扩增；

2)扩增程序

其中

步骤3.凝胶回收PCR片段，步骤如下：

配置2％琼脂糖凝胶，室温凝固至少30min；

将PCR管中样品加loading buffer后上样，电泳；

切胶回收；

切胶，尽可能去除多余胶块，称重。按1∶3体积加入溶胶液PN，50℃水浴放置10min，其间多次翻转离心管，以确保凝胶彻底溶解；

柱平衡：吸附柱中加入500uL平衡液BL，12000rpm，1min，弃废液；