[发明专利]一种人气道上皮细胞的培养方法

权利要求书

1.一种人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取原代培养的人气道上皮细胞：取离体人气管或支气管，用消化培养基在4℃消化24～48h后收集气道上皮细胞，然后接种至培养皿中，用完全培养基进行原代细胞培养，获得原代培养的人气道上皮细胞；

(2)获取传代培养的人气道上皮细胞：

当原代细胞达到70～90％融合密度后，用磷酸缓冲液溶液清洗，加入0.25％胰蛋白酶溶液，室温消化5～10分钟，当细胞出现回缩、悬浮时，收集细胞悬浮液，加入含有蛋白酶抑制剂的等量溶液，离心收集细胞，然后以1～6×10⁶细胞/ml的浓度接种于新的含完全培养基的培养皿中进行培养，3～5天细胞生长至对数生长期，获得传代培养的人气道上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中胰蛋白酶溶液中含0.02％乙二胺四乙酸；在培养皿中，每100mm单孔板的胰蛋白酶溶液的用量为1ml。

3.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中蛋白酶抑制剂为大豆胰蛋白酶抑制剂，浓度为0.5～1mg/ml。

4.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中获取原代培养人气道上皮细胞的具体步骤为：

1>在显微镜下分离弃除气管或支气管上所有额外的结缔组织，然后切成小段组织块，用预冷的生理盐水清洗，将分离干净的气管或支气管浸泡在浸泡培养基中，涡旋震荡30～60S后，浸泡5～10min，接着用洗涤培养基冲洗干净，把洗好的组织块置于离心管内，加入消化培养基，4℃，在摇床上以转速50～60r/min消化气管或支气管组织块24～48h；

2>取出经消化的气管或支气管组织块倒入培养皿中，加入胎牛血清至终体积浓度为10～20％，纵向剪开气管，用细胞刷轻刮内表面，然后用磷酸缓冲液冲洗内表面和细胞刷，收集含有脱落细胞的溶液，4℃离心5min后，用洗涤培养基清洗细胞，4℃离心5min后，用完全培养基重悬细胞；

3>用完全培养基调整细胞密度，以1～6×10⁵细胞/ml的密度接种于培养板中，于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养2～3天，得到原代培养的人气道上皮细胞。

5.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述的步骤1>中所述的浸泡培养基、洗涤培养基和消化液的用量要没过气管或支气管组织；所述的涡旋震荡条件为1000～1200r/min，所述的小段组织块的长度为5～10cm。

6.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述的完全培养基为含95～105U/ml青霉素和95～105U/ml链霉素的BEGM培养基。

7.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述的洗涤培养基为含95～105U/ml青霉素和95～105U/ml链霉素的MEM培养基。

8.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述的浸泡培养基为含95～105U/ml青霉素、95～105U/ml链霉素、0.5～1mg/ml的二硫代苏糖醇和0.5～1×10^-2mg/ml的脱氧核糖核酸酶的MEM培养基。

9.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述的消化培养基为含95～105U/ml青霉素、95～105U/ml链霉素、终浓度为0.5～1mg/ml的XIV型蛋白酶和0.5～1×10^-2mg/ml的脱氧核糖核酸酶的MEM培养基。

10.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用的培养皿为包被了0.05～0.1％的IV型胶原蛋白的普通的细胞培养皿。