[发明专利]一种突变腈水合酶

说明书

技术领域

本发明属于酶工程和工业微生物技术领域，具体涉及一种耐热和超声耐受性突变腈水合酶、该酶的构建方法及其在微生物法生产丙烯酰胺中的应用。

背景技术

微生物生产的腈水合酶，可以高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺。丙烯酰胺聚合产生的聚丙烯酰胺在三次采油、水处理、造纸等工业生产领域具有非常广泛的应用。利用微生物产生的腈水合酶催化生产丙烯酰胺具有一系列优点，包括反应在常温常压下进行、能耗低、操作简单、安全、丙烯腈转化率高、产物浓度和纯度高等，因此逐渐成为丙烯酰胺生产的主要方法。

微生物法生产丙烯酰胺的研究重点在于高产腈水合酶菌株的发现和改造以及对腈水合酶本身性能的基因工程改造。其中，在基因工程方面，日本三菱化成株式会社对来自根瘤菌属的腈水合酶基因和蛋白申请了专利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因》(申请号：93106122.9)；三井化学株式会社对来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的蛋白以及编码它的基因申请了专利《参与活化腈水合酶的蛋白以及编码它的基因》(专利号：ZL99106291.4)；《新型腈水合酶》(专利号：02156180.X)，并研究了该基因在重组大肠杆菌中的表达；德国底古萨股份公司申请了《红球菌属的腈水合酶》(申请号：200580008206.8)；清华大学公开了“一种腈水合酶及其编码基因与应用”，构建了α亚基起始密码子突变的腈水合酶，并在大肠杆菌中高活性表达(专利号：ZL 200410042576.0)；清华大学在专利“一种腈水合酶基因簇及其应用”中公开了赤(红色)红球菌Rhodococcus ruber TH中与腈水合酶高表达相关的结构基因和调控基因序列(中国专利申请号：200910076710.1)。

除了产物/底物耐受性外，在微生物法生产丙烯酰胺的催化水合过程中，制约生产效率的另一个主要问题就是产酶细胞的耐热性较差，水合温度必须通过低温制冷剂控制在15-22℃。由于腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺是强放热反应，工业生产中控温的冷量经常供应不足，导致水合温度波动到25℃以上。较高的水合温度一方面会加快反应速率，提高生产效率，另一方面则会造成腈水合酶的快速失活，减少反应批次，增加生产成本。日本三菱丽阳株式会社公开了专利《改良型腈水合酶》(公开号：CN 1961072A)，对腈水合酶β亚基第93位、第167位和219位氨基酸残基进行定点突变，提高了腈水合酶的热稳定性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种突变腈水合酶及其突变基因。

本发明的目的还在于提供含有上述腈水合酶突变基因的转化体。

本发明的目的还在于提供突变腈水合酶在制备丙烯酰胺中的应用。

一种突变腈水合酶，该突变腈水合酶的获得方法是对具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的腈水合酶中氨基酸残基的至少一个残基进行置换和添加；所述置换的残基对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的141位Ser、143位Ser、144位Leu；所述添加的残基位于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的末端残基之后，添加个数为1-2个。

所述氨基酸残基的置换包括将对应于SEQ ID NO：1氨基酸序列中141位的Ser残基置换为Lys，将对应于143位的Ser残基置换为Lys，将对应于144位的Leu残基置换为Glu；所述氨基酸残基的添加包括在SEQ ID NO：1氨基酸序列的末端添加的Asp和Thr。

上述突变腈水合酶的基因，或含有该基因的表达载体。

所述突变基因或含有该基因表达载体的转化体。

所述转化体为大肠杆菌、诺卡氏菌、红球菌或丙酸棒杆菌。

上述改良腈水合酶转化体的构建方法，可采用氯化钙法或电穿孔转化法(Sambrook J等.Molecular Cloning：A Laboratory manual.Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)将载体导入受体菌。也可以将改良腈水合酶基因直接插入转化体的染色体。

上述突变腈水合酶在制备丙烯酰胺中的应用。

本发明所述改良腈水合酶转化体的游离细胞可直接用于从丙烯腈水合制备丙烯酰胺。