[发明专利]透射电镜和能谱原位识别嗜热四膜虫体内纳米金的方法

说明书

技术领域

本发明属于环境纳米颗粒生物体定位识别及其生物毒性领域。

背景技术

纳米材料与技术已经得到广泛应用，如含有纳米银的抗菌剂、在医学成像中广泛应用的荧光量子点标示技术等，这些都与现代生活紧密相连。纳米材料与技术是一种新兴的学科，近年来，纳米材料大部分都没有经处理就直接排入到污水中，进而进入河流、海洋等自然水体环境。尽管纳米材料的生物学效应及其环境安全影响正逐渐引起人们的重视，然而原位观察纳米材料进入生物体的方式、纳米材料在新陈代谢中的循环过程以及在食物链中迁移转化、纳米材料在高端生物体的累积等都未有更深入的研究探讨。

为了解决上述问题，有报道单独用透射电子显微镜观察生物体里的纳米颗粒【P.V. Asharani, et al. Cytotoxicity and Genotoxicity of silver Nanoparticles in Human Cells. ACS NANO,2009,2:279-290】，但这种方法不能够直接识别所看到是否就是纳米颗粒成分，往往会被一些微小杂质纳米颗粒所干扰，本发明提供了一种用于透射电镜和能谱原位观察识别生物体内纳米金的方法，其特征在于通过将嗜热四膜虫在含有纳米金的液体培养基里培养一段时间后，经过固定、脱水、渗透和包埋等步骤，最后于超薄切片机下切得50-70纳米厚的超薄切片，捞网晾干，醋酸铀和柠檬酸铅染色后电镜下观察，看到颗粒后用能谱确认。本发明能够排除其他杂质纳米颗粒的干扰，实现原位观察嗜热四膜虫体内纳米金颗粒，为进一步了解纳米颗粒在生物体内的循环代谢过程和评价其生物毒性提供有效的分析方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种透射电镜和能谱原位识别嗜热四膜虫体内纳米金的方法，以解决现有单独用透射电镜观察生物体内纳米颗粒方法中存不能排除其他杂质纳米颗粒的干扰问题。

本发明的实验流程为：

1、纳米金的合成

45-50mL超纯水中加入1mL(10 g·L^-1)的HAuCl₄，加热回流，在剧烈的搅拌下，快速加入1mL(71.4 g·L^-1)的柠檬酸三钠，继续加热搅拌回流，制备好的纳米金置于4 ℃的冰箱中备用。

2、嗜热四膜虫的培养

（1）本发明试验中所用嗜热四膜虫由中科院水生生物所提供；

（2）嗜热四膜虫培养条件为黑暗30℃；

（3）液体培养基：酵母粉2.5 g·L^-1，胰蛋白胨2.5 g·L^-1，葡萄糖5 g·L^-1，FeCl₃溶液33ml，蒸馏水1L。

3、纳米金处理嗜热四膜虫

（1）纳米金胶体溶液使用前超声15分钟，然后加入已灭菌的含20 mL的培养基的三角烧瓶中，制成纳米金含量为7.2 mg·L^-1的培养基；

（2）将黑暗条件下30℃培养24小时后的嗜热四膜虫接种于步骤（1）纳米金含量为7.2 mg·L^-1的培养基中，接种量为1.5%-2.5%，培养24小时。

 4、嗜热四膜虫的透射电镜制样

a、嗜热四膜虫在纳米金培养基中培养24小时后，2000转/分钟离心5分钟后去上清；

b、2.5%戊二醛固定0.5-1小时；

c、0.1M（pH7.2）磷酸缓冲液清洗三次，每次10-20分钟；

d、0.1%锇酸固定半小时；

f、0.1M（pH7.2）磷酸缓冲液清洗三次，每次10-20分钟；

g、30%、50%、70%、90%梯度酒精脱水各一次，100%酒精脱水两次，每次10-20分钟；

h、树脂渗透两次，每次5-9小时；

i、包埋后70度烘箱聚合8小时以上；

j、超薄切片机切片，厚度为50-70纳米；

k、醋酸铀染色10-15分钟，柠檬酸铅染色15-20分钟，晾干。

5、嗜热四膜虫纳米颗粒定位观察的电镜及能谱条件

（1）样品放入电镜后，将电镜加速电压升到80-100KV，样品杆倾转11.5-12.5度；

（2）在Mag2模式下观察超薄切片，在2万倍到10万倍下寻找纳米颗粒；