[发明专利]一种盐酸克伦特罗检测试剂盒及其制备和使用方法

权利要求书

1.一种盐酸克伦特罗检测试剂盒，其特征在于：包括盒体、设在盒体内的盐酸克伦特罗酶标板，以及盐酸克伦特罗标准溶液、盐酸克伦特罗酶结合物、稀释液、浓缩洗涤液、第一底物和第二底物；

所述酶标板的板孔包被有固相化的盐酸克伦特罗抗体；

所述盐酸克伦特罗标准溶液包括浓度依次为：0 ng/ml、0.1 ng/ml、0.3 ng/ml、0.9 ng/ml、2.7 ng/ml、8.1 ng/ml的盐酸克伦特罗溶液；

所述盐酸克伦特罗酶结合物，为辣根过氧化物酶标记的盐酸克伦特罗抗原；

所述稀释液为pH=7.0的0.01M 的磷酸盐缓冲溶液；

所述浓缩洗涤液为含有体积分数0.05%的吐温-20、PH=7.5浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；

所述第一底物为每250ml含有BSA 2.5g、Tris1.5g、鲁米诺0.05g、对位碘酚0.0075g，pH=9.0的溶液；

所述第二底物为每250ml含有BSA 2.5g、Tris1.5g、过氧化氢0.25ml，pH=9.0的溶液。

2.如权利要求1所述的盐酸克伦特罗检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）盐酸克伦特罗酶标板的制备

1.1包被液的配制：稀释配制2μg/ml的盐酸克伦特罗抗体溶液；

1.2包被量：将酶标板的板孔加入上述制备的包被液100μl，4℃包被48小时；

1.3洗涤：将上述包被后的酶标板用浓缩洗涤液洗涤两次；

1.4封闭：将上述洗涤后的酶标板板孔每孔加封闭液130μl，室温20-25℃封闭3小时；

1.5干燥：将上述封闭后的酶标板板孔中的封闭液甩出，然后18-25℃干燥48小时；

1.6将上述干燥后的酶标板装入铝箔袋，封口，备用；

（2）盐酸克伦特罗标准溶液的配制

2.1制备浓度为100μg/L的盐酸克伦特罗溶液；-20℃避光保存；

2.2配制8.1 ng/ml的盐酸克伦特罗标准溶液；

2.3将8.1ng/ml的盐酸克伦特罗标准溶液用稀释液进行倍比稀释，依次配制2.7 ng/ml、0.9 ng/ml、0.3 ng/ml、0.1 ng/ml标准品溶液；0 ng/ml为未添加盐酸克伦特罗的稀释液；

（3）盐酸克伦特罗酶结合物的制备

用辣根过氧化物酶标记盐酸克伦特罗抗原，工作浓度为体积比1: 2000，得到盐酸克伦特罗酶结合物；

（4）稀释液的配制

配制pH=7.0的0.01M PBS溶液；

（5）浓缩洗涤液的配制

配制含有体积分数0.05% 吐温-20、PH=7.5、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液作为浓缩洗涤液；

（6）第一底物的配制

称取BSA 2.5g、Tris 1.5g，加入容量瓶；加水溶解，定容至250ml；再用HCl调节pH至9.0，完全混匀；再称取鲁米诺0.05g、对位碘酚0.0075g，倒入上述容量瓶，充分溶解，摇匀；

（7）第二底物的配制

称取BSA 2.5g、Tris1.5g，加入容量瓶；加水溶解，定容至250ml；再用HCl调节PH至9.0，完全混匀；取0.25ml H₂O₂加入上述液体中，混匀。

3.如权利要求1所述的盐酸克伦特罗检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

（1）样品的制备

1.1尿液样品

离心：清亮尿样可直接测定；如尿样浑浊，则需过滤或3000r离心5min，取上清液50μl检测；检测稀释倍数：1；

1.2饲料样品

取1g均质化后的饲料样品于50ml试管中，加入10ml 0.1M的HCl溶液，用振荡器剧烈振荡5min，3000r离心10min；取上述离心后的上清液1ml加入20μl 1M 氢氧化钠溶液混匀；3000 r离心10分钟；取50μl上清液用于检测，检测稀释倍数：10；

1.3肌肉、肝等组织

称取3.0±0.05g均质化后的组织样本至50ml离心管中；加入6ml 3%的三氯乙酸，用振荡器振荡摇至均匀，颠倒混匀10min；3000r以上离心10分钟；将上述离心后的上清液取3ml转入20ml试管，加3ml异丙醇-乙酸乙酯混合液，体积比2：3，震荡10min，静置5min；然后，3000r以上离心10分钟；取1.5ml上述离心后的上层有机相于小烧杯或玻璃试管中，60℃氮气吹干；用2ml稀释液充分溶解；取50μl上清液用于检测，检测稀释倍数：4；

1.4肌肉蒸煮法

称取10g均质化后的肌肉样本于50ml离心管中；将离心液放入沸水浴中蒸10min；水浴后取上层渗出液1ml，直接取50μl用于检测，检测稀释倍数：1；

（2）加样检测

将在冷藏环境中贮藏的试剂室温25℃平衡；

2.1将浓度分别为：0 ng/ml、0.1 ng/ml、0.3 ng/ml、0.9 ng/ml、2.7 ng/ml、8.1 ng/ml的盐酸克伦特罗标准溶液和待测样品按浓度由低到高加入酶标板的板孔中，每孔50μl；

2.2然后将100μl稀释的酶结合物即辣根过氧化物酶标记的CL抗原，1:2000稀释倍数，加入到板孔底部，用震荡机震荡30秒，盖上封板膜，25℃温育30分钟；

2.3用洗涤液洗涤，方法是向板孔中每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干，重复5次；

2.4第一底物和第二底物以体积比1：1混合均匀，加入到板孔中，每孔加入50μl，震荡20秒；

2.5震荡后10分钟测定结果，使用微孔板化学发光免疫分析仪及化学发光检测软件进行分析；

（3）检测结果

根据各标准溶液发光值，借助化学发光检测软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线，根据标准曲线即可推算出盐酸克伦特罗的浓度，然后乘上相应的稀释倍数，即获得样品稀释前实际的克伦特罗含量。