[发明专利]一种提取河蟹绒毛DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及河蟹绒毛DNA的提取方法，具体地，涉及一种快速、方便、无损伤生物体的提取高质量DNA的方法。

背景技术

河蟹包括中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、日本绒螯蟹(Eriocheir japonica)和合浦绒螯蟹(Eriocheir hepuensis)等，它们均隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustaceae)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)，绒螯蟹属(Eriocheir)。中华绒螯蟹是我国重要的经济甲壳动物和水产养殖对象，在我国自然分布广泛，但主要分布于长江、辽河以及瓯江流域。自20世纪80年代后期，河蟹的人工养殖和苗种培育迅猛发展，出现了中华绒鳌蟹盲目的人工移殖，已造成各水系绒鳌蟹种质资源混杂和性状衰退。鉴于此，为保证中华绒螯蟹宝贵物种资源的可持续利用，必须加强对其遗传资源的研究，分析其遗传多样性。

然而，进行河蟹的遗传研究以及种质资源的提纯和复壮，需要对大量的河蟹样本进行分子生物学分析，而进行分子生物学分析工作的基础是获得良好的DNA以及RNA等样本。传统的河蟹DNA提取往往利用河蟹的肌肉进行细胞裂解消化，然后提取DNA，这种提取DNA的方法对河蟹具有很严重的损伤，往往会影响一些优质河蟹的后期育种工作，由于缺少了部分的步足，会导致河蟹的抱卵率低、成活率低、甚至死亡的现象，严重制约了河蟹的人工育苗技术，进而影响了河蟹的遗传改良工作。由此可见，开展河蟹无损伤的DNA提取方法十分重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：通过设计河蟹绒毛细胞的裂解缓冲液和饱和NaCL法提取河蟹基因组DNA，提供一种简便、快速、高效的提取河蟹绒毛DNA的方法，提取河蟹绒毛DNA质量高，可用于种质研究与遗传分析，既保障河蟹活体的无损伤，又满足了实验DNA样本的需求。

本发明提供的技术方案是：一种提取河蟹DNA的方法，包括如下步骤：

(1)剪取河蟹绒毛；

(2)提取河蟹绒毛DNA，步骤如下：

a.将第(1)步剪取的河蟹绒毛加裂解缓冲液和蛋白酶K进行消化，其中裂解缓冲液的成分与浓度为：0.05M EDTA，2％SDS，0.01M Tris-Cl，0.3M乙酸钠，10mg/ml DTT；

b.将步骤a得到的消化液离心，取上清液加饱和NaCl溶液和氯仿，混匀；

c.离心，取上清液加入异丙醇；

d.离心沉淀DNA；

e.洗涤DNA，轻摇混匀；

f.离心，将沉淀DNA烘干；

g.在烘干后的DNA加去离子水或TE溶液，并加入RNA酶去除DNA中的RNA，保存备用。

所述的提取河蟹绒毛DNA的方法，第(1)步中，剪取河蟹螯足上的绒毛少许，剪取过程中尽量取靠近基部毛囊部的绒毛。

所述的提取河蟹绒毛DNA的方法，步骤a中，优选地，河蟹绒毛的根数与加裂解缓冲液和蛋白酶K的量之间的关系是：河蟹绒毛15-20根，加500ml裂解缓冲液和浓度为20mg/ml的蛋白酶K 20μL，于56℃的的烘箱中过夜消化，至澄清的裂解缓冲液转变为混浊呈橙黄色为止。

本发明具有如下优点：

本发明方法是本发明人近几年在对中国各水系河蟹DNA提取的不断摸索过程中，选择河蟹绒毛作为提取DNA的材料，通过设计河蟹绒毛细胞的裂解缓冲液，利用河蟹鳌足上的绒毛通过饱和NaCL法提取河蟹基因组DNA可以满足不伤害河蟹自身，又能获得良好的DNA的要求，不仅在科学技术上，而且在河蟹种质资源保护与利用上均具有十分重要的意义和价值，而且对其它甲壳动物的DNA提取也具有借鉴作用。

本发明方法可简便、快速、有效的提取河蟹绒毛DNA，提取的DNA质量高，不受蛋白质的污染，提取的绒毛DNA可用于分子生物学分析，从而为河蟹的遗传多样性研究、种质保护和资源利用提供一项技术手段，具有重大科学意义和实用价值。

附图说明

图1为本发明提取DNA的电泳直接检测结果；

图2为本发明提取DNA的微卫星引物PCR扩增检测结果。

具体实施方式

一、绒毛采取

1.剪取河蟹螯足(蟹钳)上的绒毛少许，剪取过程中尽量取靠近基部毛囊部的绒毛。

2.剪取的绒毛用去离子水清洗两遍，去除绒毛上的灰土等杂质，洗净后的绒毛用于DNA直接提取，或保存于95％的酒精中备以后提取DNA。

二、绒毛DNA提取