[发明专利]单纯疱疹病毒1型和2型同时检测鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒1型和2型同时检测鉴定方法。 

技术背景

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)能引起人类多种疾病，如龈口炎(gingivostomatitis)、角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)、脑炎(encephalitis)以及生殖系统感染和新生儿的感染。在感染宿主后，常在神经细胞中建立潜伏感染，激活后又会出现无症状的排毒，在人群中维持传播链，周而复始的循环。 

单纯疱疹病毒感染在我国非常普遍，发病率高，可通过胎盘及产道感染新生儿，导致流产及新生儿死亡，与宫颈癌的发生也有关，危害较大，因属病毒感染，又无特效疗法，所以给人带来很大痛苦。HSV分为1型(HSV-1)和2型(HSV-2)，两者基因组的相似度大约在50％，1型疱疹病毒主要通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，主要感染腰以上部位的粘膜组织和器官。如引起口唇黏膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹，口和口周围发生的疱疹，99％是由1型疱疹病毒引起的。2型疱疹病毒主要存在于女性宫颈、阴道、外阴皮肤及男性的阴茎、尿道等处，是引起生殖器发炎和疱疹的罪魁祸首，据有关资料表明，生殖器的病原体90％为2型疱疹病毒，仅10％为1型疱疹病毒。在治疗方面，HSV-1引起的症状较轻，用药后较易治疗，所以有效的区分两种病毒感染对临床用药有一定的指导意义。 

目前，临床上对单纯疱疹病毒的检测方法：分离培养是检测HSV的金标准，但该方法操作十分繁琐，且有一定的危险性，时间耗费长。临床上常用ELISA和间接免疫荧光来检测HSV的特异性抗体，但在疾病早期(即窗口期)无法检测到病毒抗体，而且病毒抗体存在时间较长，治疗成功后仍有抗体存在，在诊断方面会有一定的困扰，所以选择核酸检测是检测病原体的最佳方法。研究证实，在生殖器溃疡愈合过程中，荧光探针定量PCR检测无症状排毒更为灵敏。因此，对于疱疹已结痂者，或无痂状排毒的患者，用实时荧光定量PCR技术检测单纯疱疹病毒可作为首选。 

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术(HIGUCHIR，FOCKLERC，DOLLINGER G，et al.Kinetic PCR analysis：real-time monitoring of DNA amplification reactions[J].Biotechnology，1993，11：1026；韩俊英，曾瑞萍.荧光定量PCR技术及其应用[J].国外医学遗传学分册，2000，23(3)：177.，在此全文引用作为参考，如同全文叙述一样)。 

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、肝炎类病毒、人结核分枝杆菌、细小病毒B19、EB病毒和人巨细胞病毒等多种病原体进行测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。 

本发明利用HSV-1和HSV-2的基因组差异，设计1对上游引物和下游引物，根据扩增的靶片段分别设计Taqman探针，并对两条探针进行不同的荧光标记，实现了在同一反应管中同时检测HSV-1和HSV-2，并通过不同的荧光通道加以鉴别，扩增的同时可以直接在软件上判读结果，而不用跑电泳，避免了气溶胶污染，在临床上有更大的应用前景。 

发明内容

针对鉴定和检测单纯疱疹病毒需时间长和分型需要，及普通PCR容易造成气溶胶污染的缺点，本发明提供了一种单纯疱疹病毒1型和2型同时检测或鉴定方法。