[发明专利]固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于白藜芦醇技术领域，具体涉及白藜芦醇的制备方法。

背景技术

白藜芦醇(化学名为芪三酚)是含有芪类结构的非黄酮多酚类化合物，是植物在受到应激时自身合成的一种抗毒素，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂。主要有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基、保护肝脏、保护心血管和抗心肌缺血等功能，被广泛应用于食品保健品、化妆品及医药领域。

目前白藜芦醇的生产主要是植物提取法。提取白藜芦醇的植物有葡萄、花生、桑葚、虎杖等。然而，植物中的白藜芦醇含量非常低，使得其分离纯化成本偏高。而白藜芦醇类似物白藜芦醇苷在植物中的含量为白藜芦醇的7～12倍，如果将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，白藜芦醇的产率可大大提高。酶法水解白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，因条件温和，反应产物较单一，产率高，而被广泛采用。

现有的制备白藜芦醇的方法，如2008年9月3日公开的公开号为CN101255449的“β-葡萄糖苷酶在转化白藜芦醇苷制备白藜芦醇中的应用”专利，公开的是以含白藜芦醇苷的植物为原料，先利用微生物法发酵制得β-葡萄糖苷酶，再经酶转化、离心、乙醇提纯而得产品。该方法的主要缺点是：①利用微生物法发酵制得的β-葡萄糖苷酶在水解反应中是以游离状态发挥催化作用，游离状态的酶在水溶液中不稳定，对热、强酸、强碱、高离子浓度、及有机溶剂等均敏感，容易失活。②游离状态的酶难以与反应产物分离，导致产物纯化困难，增加生产成本。③游离状态的酶只能使用一次，酶的用量较大，不利于节约能源。④不能连续进行生产，延长了生产周期，对原料的利用率低。

发明内容

本发明的目的是针对现有制备白藜芦醇方法的不足之处，提供一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法。具有操作简单实用、设备通用、酶稳定性好、重复利用率高、节约能源、无有害物质排放，清洁安全，生产成本低，可连续生产等特点。

本发明的主要原理是：在适宜条件下，以二醛类化合物与接枝赖氨酸壳聚糖微球的游离氨基及β-葡萄糖苷酶的游离氨基发生交联反应，就将游离β-葡萄糖苷酶束缚于接枝赖氨酸壳聚糖微球载体，即制备出固定化酶；固定化酶具备与游离酶同样的水解特性，可反复使用，连续水解白藜芦醇苷，生成白藜芦醇。

实现本发明目的的技术方案是：一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂、β-葡萄糖苷酶、白藜芦醇苷和XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先制备出固定化β-葡萄糖苷酶，后装柱成柱式酶反应器，再经连续水解，吸附，洗脱，结晶得到白藜芦醇产品。其具体步骤如下：

(1)配制β-葡萄糖苷酶缓冲溶液

以市售的β-葡萄糖苷酶为原料，按照β-葡萄糖苷酶的质量(mg)∶缓冲溶液体积(L)比为1∶0.5～1.5的比例，将β-葡萄糖苷酶加入缓冲溶液中，搅拌混合均匀，就制备出β-葡萄糖苷酶缓冲溶液。其中，所述的缓冲溶液为pH值6.0～8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。

(2)制备固定化β-葡萄糖苷酶

第(1)步完成后，以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树为原料，按照赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量(g)∶第(1)步制备出得β-葡萄糖苷酶缓冲溶液的体积(mL)∶1％的戊二醛溶液的体积(mL)比为1∶10～20∶1～3的比例，先将赖氨酸修饰的壳聚糖微球阳离子交换树脂加入到β-葡萄糖苷酶缓冲溶液中，搅拌吸附1～3小时后再加入戊二醛溶液，反应1～3小时后将反应产物放置于真空过滤器中，进行真空过滤，分别收集滤液和滤渣。对于收集的滤液，用于回收缓冲溶液。对于收集的滤渣，按照滤渣的质量(g)∶缓冲溶液体积(mL)之比为1∶10～50的比例，用缓冲溶液对糖渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣。再按洗涤后的滤渣的质量(g)∶缓冲溶液的体积(mL)之比为1∶10～50的比例，再用缓冲溶液对洗涤后的滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣。如此重复，直至洗涤液中检测不出酶蛋白质为止。最后合并各次收集的洗涤液和第(2)步收集的滤液，用于回收缓冲溶液。对于洗涤后的滤渣，即为制得的固定化β-葡萄糖苷酶，用于组装固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器。其中，所述的缓冲溶液为pH值6.0～8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液

(3)制备白藜芦醇苷水解液