[发明专利]真菌毒素复合免疫吸附剂和免疫亲和柱与试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫吸附剂，以及装有该免疫吸附剂的免疫亲和柱和试剂盒及其它们在纯化黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素、玉米赤霉烯酮同类物α-ZER、α-ZOL、β-ZER、β-ZOL、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A中的应用。

背景技术

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等产生的一组结构类似的次生代谢产物，是一组以二吠喃香豆素为基本结构的化合物。目前已分离鉴定出12种，尤其是黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂、M₁和M₂为强污染物质，广泛存在于粮食谷物和饲料及其加工品中，在目前已知的两百多种真菌毒素中毒性最强、污染频率最高。黄曲霉毒素具有诱导突变、抑制免疫和致癌的作用。黄曲霉毒素作用的靶器官主要是肝脏，被公认为致肝癌物质，即使食用含有低水平的黄曲霉毒素食物，长期食用的人其肝脏也将受到损害。国际癌症中心将其定为一类致癌剂。

玉米赤霉烯酮又称F-2毒素，它首先从有赤霉病的玉米中分离得到。玉米赤霉烯酮的产毒菌主要是镰刀菌属的菌株，如禾谷镰刀菌和三线镰刀菌。玉米赤霉烯酮及其同类物主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物，其中，玉米的阳性检出率为45％，最高含毒量可达到2909mg/kg；小麦的检出率为20％，含毒量为0.364-11.05mg/kg。玉米赤霉烯酮及其同类物的耐热性较强，110℃下处理1h才被完全破坏。玉米赤霉烯酮及其同类物具有雌激素作用，主要作用于生殖系统，可使家畜、家禽和实验小鼠产生雌性激素亢进症。妊娠期的动物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮及其同类物的食物可引起流产、死胎和畸胎。食用含赤霉病麦面粉制作的各种面食也可引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心、发冷、头痛、神智抑郁和共济失调等。

杂色曲霉素是由杂色曲霉、构巢曲霉等产生的一种具有致癌性的真菌毒素，在化学结构上属于黄曲霉毒素前体物质，可与DNA形成加合物。杂色曲霉素产生菌及杂色曲霉素在世界各地粮食及饲料中的污染很常见。国内学者研究发现，我国各地粮食中杂色曲霉素的污染非常普遍，其中以小麦最明显，污染率最高可达100％。杂色曲霉素可能与胃癌、肝痛的发生密切相关。

赭曲霉毒素是由赭曲霉和纯绿青霉产生的一种霉菌肾毒素，可分为A和B两种类型，赭曲霉毒素A的毒性较大。赭曲霉毒素在4℃的低温下赭曲霉即可产生具有毒害作用浓度的赭曲霉毒素。动物摄入1ppm体重剂量的赭曲霉毒素A可在5-6天致死。常见的病变是肾小管上皮损伤和肠道淋巴腺体坏死。饲喂含1ppm浓度赭曲霉毒素的日粮3个月可引起动物烦渴、尿频、生长迟缓和饲料利用率降低；饲喂含量低至200ppb的日粮数周可检测到肾损伤。其他的临床症状还有腹泻、厌食和脱水。有时临床症状不明显，而在赭曲霉毒素中毒呈地方流行病的地区，动物在屠宰时惟一可观察到的病变是肾苍白、坚硬。

目前，黄曲霉毒素、杂色曲霉素、玉米赤霉烯酮同类物和赭曲霉毒素A的检测方法主要有薄层层析法，酶联免疫法(ELISA)，免疫亲和层析-液相色谱法，免疫亲和层析-荧光光度法等。其中，薄层层析法要接触大量的标准品，不利于实验者的健康，而且灵敏度很低。酶联免疫法，只适用于定性检测，很容易出现假阳性和假阴性的现象。而免疫亲和层析-液相色谱法可以定量地检测许多商品中的黄曲霉毒素的含量。由于该方法灵敏特异，而且不使用有毒的溶剂如氯仿和二氯甲烷等，应用越来越广泛。

免疫亲和层析方法的关键在于选择一种高效特异的抗体，但是，利用现有技术中的液液提取、固相萃取、加热蒸发浓缩等方法的添加回收率均较低，对后续的检测步骤造成很强的基质效应，并且现有技术中没有能够同时纯化待处理基质中6种黄曲霉毒素(B₁、B₂、G₁、G₂、M₁和M₂)、6种玉米赤霉烯酮同类物(α-ZER、α-ZOL、β-ZER、β-ZOL、ZAN和ZON)、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的免疫吸附介质，而能够同时纯化分析多种病毒素显然能够提高检测的效率。

因此，当务之急，是要制备出性能稳定、特异的免疫吸附剂，并建立一种经济、快捷、精确、安全，并且能同时纯化6种黄曲霉毒素、6种玉米赤霉烯酮、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法。

发明内容