[发明专利]磷酸化肌球蛋白和驱动蛋白的激酶的发现

说明书

技术领域：

本发明属于基础生命科学，生物化学，细胞生物学，分子生物学，脑科学，神经细胞骨架学和神经细胞信号转导学等多个领域，创新性地揭示了同时调节细胞肌球蛋白和驱动蛋白的新机理和神经细胞形成及工作的基本原理。 

背景技术：

生命在于运动，探索生命运动的原理是生命科学的最重要领域之一。肌球蛋白(myosin)和驱动蛋白(kinesin)作为细胞运动的主要分子马达，在肌肉收缩，细胞内物质，小胞和膜细胞器的输送以及动态细胞骨架的构成和功能上起着重要的作用。 

细胞微管和微丝的动态和神经细胞轴突的形成，细胞分裂以及细胞移动等有密切的关系。肌球蛋白和驱动蛋白分别与细胞微丝和细胞微管紧密地协作，担负着各种复杂细胞运动的使命。揭示调节肌球蛋白和驱动蛋白功能的基本分子原理是生命科学家的最热衷研究领域之一。还没有关于既磷酸化肌球蛋白也磷酸化驱动蛋白的激酶的报道。模式生物秀丽线虫和哺乳动物的神经系统在形态学和生物化学上是相似的；一个保存性基因在秀丽线虫和哺乳动物的不同实验系里能表达相同的功效。秀丽线虫的unc-51基因编码一个从线虫到人类的进化上具有保存性的丝/苏氨酸蛋白激酶，是神经形成所必须的；这个基因的突变引起线虫的神经形成及运动的欠缺和短粗体形。揭示unc-51基因所编码的蛋白激酶的底物和其生物化学功能的意义是重要的。 

发明内容：

本发明的目的在于揭示unc-51基因所编码的蛋白激酶的重要底物和其生物化学功能，弄清楚神经细胞形成的分子机理，为神经疾病的治疗提供崭新的原理和方法。本发明的内容为： 

(1)首次揭示肌球蛋白和驱动蛋白都能够结合UNC-51激酶 

肌球蛋白及驱动蛋白和UNC-51激酶的体外结合如图1所示。图1显示体外酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果，肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MHC)，肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)和驱动蛋白重链(myosin heavy chain，KHC)都能够在体外结合UNC-51激酶。 

(2)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性既能够磷酸化肌球蛋白也能够磷酸化驱动蛋白 

图2显示UNC-51激酶在体外能够磷酸化肌球蛋白重链(MHC)并自我磷酸化。 

图3显示UNC-51激酶在体外能够磷酸化肌球蛋白轻链(MLC)并自我磷酸化。 

图4显示用凝胶移位分析法的结果，UNC-51激酶在体内(HeLa细胞)能够磷酸化驱动蛋白。 

图5表示UNC-51激酶活性通过对肌球蛋白和驱动蛋白的磷酸化反应诱导神经轴突形成的模型。 

附图说明：

图1肌球蛋白及驱动蛋白和UNC-51激酶的体外结合 

图2UNC-51激酶在体外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化 

图3UNC-51激酶在体外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化 

图4UNC-51激酶在体外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化 

图5UNC-51激酶活性通过对肌球蛋白及驱动蛋白的磷酸化反应诱导神经轴突形成的模型 

具体实施方式：

【1】肌球蛋白及驱动蛋白和UNC-51蛋白激酶结合的测定 

用细胞溶解缓冲液溶解表达UNC-51蛋白激酶的HEK293细胞，得到溶胞产物的上清。利用亲和层析法从以上溶胞产物的上清纯化得到UNC-51蛋白激酶。运用固相酶联免疫测定法(ELISA)分析肌球蛋白及驱动蛋白和UNC-51蛋白激酶的体外结合。 

【2】激酶活性的测定 

在含有50μM末端放射性表记的腺苷三磷酸[γ-³²P]-ATP的Hepes激酶缓冲反应液(pH7.4)中，进行了UNC-51蛋白激酶磷酸化肌球蛋白及驱动蛋白的反应。用6.5％的SDS-PAGE和X-线胶片放射自显影法分析测定了激酶活性。 

用凝胶移位分析法发现了UNC-51激酶在体内(HeLa细胞)能够磷酸化驱动蛋白。