[发明专利]敲除氧-甲基转移酶基因获得格尔德霉素衍生物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用分子生物学手段，通过敲除参与链霉菌活性代谢产物生物合成的基因获得新化合物的方法。 

背景技术

以格尔德霉素（geldanamycin）为代表的苯醌安莎类化合物（benzoquinone ansamycin）是目前研究最多、效果很好的抗肿瘤化合物之一。此类化合物的抗肿瘤机制是与肿瘤细胞中的热休克蛋白（heat shock protein）Hsp90 特异结合，导致肿瘤细胞内许多需要Hsp90 维持功能的重要蛋白质迅速降解，从而抑制肿瘤细胞的生长或引发肿瘤细胞死亡。虽然格尔德霉素具有很强的抗肿瘤活性，但因其毒副作用大、水溶性差和稳定性差，不适合临床使用。通过对格尔德霉素一些化学基团进行修饰，可以提高其活性并降低毒性。目前多种极具潜力的格尔德霉素衍生物已经进入临床实验，这些化合物的共同特点是在格尔德霉素的碳-17位进行了不同程度的修饰。 

苯醌安莎化合物的生物合成是以3-氨基-羟基苯甲酸为起始物，通过聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）逐步加入一些延伸元件如乙酸、丙酸和羟基乙酸等，形成一个聚酮的核心结构，最后再经过后修饰酶进行修饰而成。目前国内外对于此类化合物的生物合成研究表明，其合成核心结构的PKS酶很相似，主要区别在于后修饰，其中最为重要的是碳-17位的修饰，修饰的结果对该类化合物的抗肿瘤活性及细胞毒性具有很重要的影响。虽然多个苯醌安莎化合物生物合成的基因簇已经克隆，如吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）NRRL 3602 中格尔德霉素生物合成基因簇和吸水链霉菌AM 3672中的除莠霉素（herbimycin）基因簇等，但是编码参与17-氧甲基化的酶的基因一直未能找到。 

我们从一株产格尔德霉素的放线菌新种――自溶链霉菌（Streptomyces autolyticus CGMCC 0516）（ZL 00134063.8）中克隆并测序了格尔德霉素生物合成的全基因簇，首次发现了编码参与碳-17位修饰的氧-甲基转移酶基因，并通过体内和体外实验证明了此基因的功能，有关该基因的研究尚未见报道。在此基础上，我们对自溶链霉菌野生型菌株进行了遗传改造，负责格尔德霉素生物合成途径中碳-17位甲基化的氧-甲基转移酶基因（gdmMT）被敲除后，菌株完全丧失了产生格尔德霉素的能力，却能够产生17-氧-去甲基格尔德霉素（17-O-Demethyl-geldanamycin）和17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-Amino-17-demethoxy-geldanamycin）。其中17-氧-去甲基格尔德霉素可作为格尔德霉素碳-17位改造的起始物质，通过结构改造可能获得具有更好药理学特性的抗肿瘤药物。而17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素是目前最有前途的格尔德霉素类抗肿瘤药物，目前正由美国Infinity Pharmaceuticals开发，并进入一期临床试验。但是17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素的生物合成至今未见报道。 

本发明涉及的17-氧-去甲基格尔德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素可以通过所构建的氧-甲基转移酶基因敲除工程菌发酵产生，与化学合成方法相比，更加经济、环保，并可持续利用。 

发明内容

本发明构建了自溶链霉菌的全基因文库，以gdmN和gdmAI基因片段为探针通过菌落原位杂交和Southern杂交筛选获得格尔德霉素生物合成基因簇，采用鸟枪法对所克隆基因簇DNA序列进行了测定，并从中发现了苯醌安莎类化合物生物合成基因簇中都未见报道的氧-甲基转移酶基因，此基因编码氧-甲基转移酶的功能经体内和体外实验证实。采用Red/ET 一步PCR法构建了该氧-甲基转移酶基因的敲除突变株，发酵产物分析表明，所构建氧-甲基转移酶基因敲除工程菌能够产生17-氧-去甲基格尔德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素。本发明提供了构建该氧甲基转移酶基因敲除工程菌的方法，以及通过发酵获得17-氧-去甲基格尔德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素的方法。本发明所涉及的17-氧-甲基转移酶基因全长678个核苷酸，蛋白质全长225个氨基酸。本发明基因工程菌自溶链霉菌（Streptomyces autolyticus，CGMCC 0516）氧-甲基转移酶（GdmMT）突变株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：武汉大学，保藏编号：M 2011200，保藏日期：2011年6月16日。 

附图说明：