[发明专利]水生黄杆菌及其在微生物转化制备L-色氨酸中的应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株新的产L-酰胺酶菌株——水生黄杆菌(Flavobacteriumaquati)ZJB-09211，及其在微生物转化制备L-色氨酸中的应用。

(二)背景技术

L-色氨酸在生物体内不能自然合成，需要从食物中摄取，是动物和一些真菌生命活动中的必需氨基酸。L-色氨酸在蛋白质中含量很低，平均含量约1％或更少。L-色氨酸能调节蛋白质的合成、调节免疫及消化功能、增加5-羟色胺代谢作用以及增强认知能力等，因此在人和动物的新陈代谢、生长发育中有重要作用。L-色氨酸的这些营养和药用价值使其被广泛应用于医药、饲料和食品等行业。

L-色氨酸可以采用蛋白质水解法、化学合成法-和微生物法来生产。微生物法大体上可分为酶促转化法和直接发酵法：

1982年日本的Nakai(EP 43211)利用L-酰胺酶将DL-色氨酰胺水解获得L-色氨酸及D-色氨酰胺，然后再利用化学法生产D-色氨酸，其得率达到92％。Komeda和Asano(Enzyme and Microbial Technology，2008，43：276-283)于2008年从Brevibacterium iodinum中克隆了具有D-氨基酰胺酶，该酶对多种不同类型的氨基酰胺都具有很好的酶活，其对色氨酰胺也具有一定的活力。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株可用于制备光学纯L-色氨酸的新菌种——水生黄杆菌(Flavobacterium aquati)ZJB-09211，及其在微生物制备L-色氨酸中的应用。

本发明采用的技术方案是：

水生黄杆菌(Flavobacterium aquati)ZJB-09211，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期2011年10月17日，保藏编号CCTCC NO：M 2011354。

该新菌株的特征如下：

生理生化特征：革兰氏阴性，接触酶阳性，氧化还阳酶阳性，其他阳性项目是：组氨酸同化、D-麦芽糖、乙酸盐、丙酸盐同化、水杨素、DL-乳酸盐同化，戊酸盐同化、D-蜜二糖、葵酸盐、丙氨酸同化、D-葡萄糖、蔗糖、脯氨酸、N-乙酰-葡萄糖胺、丙二酸盐利用；全部阴性的项目是：柠檬酸盐利用、衣康酸盐同化、D-甘露醇、阿拉伯糖、3-羟基-丁酸盐、D-山梨醇、4-羟基-苯甲酸盐同化、3-羟基-苯甲酸盐同化、D-核糖、2-酮基葡萄糖、肌醇、糖原、L-岩澡糖、5-酮基葡糖酸盐、辛二酸盐同化、丝氨酸同化、明胶液化、L-鼠李糖、吲哚产生。

本发明所涉及的微生物是通过以下的程序筛选得到的：

1)将由浙江省内各地采回的土样和污水样接种到富集培养基中，在30℃，150rpm的摇床上培养3天，待培养基变混浊后，取1ml培养液转接到新鲜的富集培养基中，再培养3天。如此重复4～5个循环。富集培养基以1～2.5g/L(终浓度)色氨酰胺为唯一碳、氮源，再加入其他物质配方如下(终浓度)：K₂HPO₄·12H₂O：1.0～2.5g/L，KH₂PO₄：1.0～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O：0.2～0.5g/L，FeSO₄·7H₂O：0.01～0.05g/L，以自来水配制。

2)最后一次富集培养液稀释后涂布到平板培养基上，挑取单菌落至斜面保藏。平板培养基为富集培养基中加入15～20g/L的琼脂。

3)挑取的单菌落接种到发酵培养基，组份如下(终浓度)：葡萄糖10.0～20.0g/L，牛肉膏5.0～10.0g/L，蛋白胨2.0～5.0g/L，NaCl 1.0～3.0g/L，K₂HPO₄1.0～2.0g/L，KH₂PO₄1.0～2.0g/L，MgSO₄0.2～0.5g/L，FeSO₄0.01～0.05g/L，乙酰胺2.0～5.0g/L，pH自然(121℃下，灭菌20min)，自来水配制；25～45℃下，摇瓶转速100～300rpm，培养48h～72h，离心后悬浮于蒸馏水体系中。然后利用手性液相色谱法筛选产L-酰胺酶的菌株。