[发明专利]一种大通量鉴定苏云金芽孢杆菌毒力基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴定苏云金芽孢杆菌毒性基因的方法及其应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了390多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类。一般而言，Cry1，Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cry1和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于蚊虫的防治。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性。

由于大规模和反复使用苏云金芽胞杆菌，许多昆虫种群已相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(M cGaughey，W.H.1985.Science.229：193-195)，原因主要是持续使用单品种的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik，B E，et al.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91：4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性。

为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。而传统的寻找新基因的方法几乎都是基于PCR，常用的方法有多重PCR，PCR-RFLP，Exclusive PCR，随机扩增多态性DNA(RAPD)鉴定，核酸分子杂交，基因芯片，蛋白鉴定。这些方法都有其缺点以及不足，例如采用PCR相关方法需要合成大量的引物，对于不同的基因类型需要进行多次的PCR，十分耗时。核酸分子杂交，则需要合成大量的DNA探针等，这些方法对于一些与已发现的基因同源性低，很新的基因不能有效的识别，因此会失去大量的新模式基因。

发明内容

本发明的目的在于针对传统鉴定新基因方法的不足提供一种新的鉴定Bt毒力基因资源的方法。

本发明的目的还在于提供一种大规模、高通量的获得Bt毒力基因的方法。

本发明的技术方案如图1所示。本发明是混合多株Bt菌株的基因组，进行测序，通过测序结果的组装，结合与数据库PFAM，GO，KEGG，Trimble的比对结果，提取毒力基因相关的CDS序列，通过NCBI的比对结果对所选的毒力基因相关CDS进行分类，可鉴定出总基因组中所含的基因类型。再根据比对结果设计相应的引物，提取所选菌株的基因组，使用所设计的引物对待测菌株的基因组进行PCR扩增，克隆得到大量的Bt毒力基因。

本发明提供了一种高通量鉴定细菌功能基因的方法，包括以下步骤：

(1)选取在光学显微镜或者扫描电镜下具有伴胞晶体的菌株作为目标菌株，提取质粒和基因组后，混合；