[发明专利]一种抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体片段的制备方法，特别涉及一种抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法。

(二)背景技术

人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，分子量约为38000D，hCG的合成与分泌与妊娠是密切相关的。hCG的检查可作为早孕检测的一项重要指标，采用抗hCG单克隆抗体进行早孕检测，可以进一步提高早期妊娠诊断的敏感性和特异性。而且hCG的含量与许多肿瘤性疾病有着密切的联系，可将hCG看作是肿瘤标志物之一，因此hCG的检查也可对滋养层细胞肿瘤和非滋养层细胞肿瘤的诊断与治疗监测提供依据。近年来发现，恶性肿瘤如胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等血中hCG也可升高，在患膀胱癌、胰腺癌、结肠癌的个体的血清中常可检测得到hCGβ亚基蛋白有明显地提高，而且在肿瘤组织中通过过氧化物酶染色法也可以检测到。

另外相对于单克隆抗体，单克隆抗体片段(包括Fab和F(ab′)2片段)具有更多优势(1)不受位于巨噬细胞、B细胞、T细胞、中性粒细胞和巨细胞等细胞上的Fc受体的影响；(2)不沉淀抗原；(3)在正常组织中分解放射性标记片段比整个IgG偶联物更快；(4)降低免疫原性(Fc区缺失)，使人抗鼠免疫球蛋白(HAMA)反应最小化；(5)更不易遭到吞噬细胞攻击；(6)分子量小，到达肿瘤部位迅速。

因此，若能研制出高纯度、效果好、免疫原性弱的人绒毛膜促性腺激素(hCG)单克隆抗体片段，并应用与诊断试剂的开发，必将带来可观的社会与经济效益。

根据目前国内外文献及专利报道，抗体片段的制备，都采用游离的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解抗体再经过多步分离纯化制得，该类方法存在游离酶无法重复利用，去除游离酶同时会降低产物回收率等问题。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法，该方法操作简便、纯化步骤少、所得抗体片段纯度高。

本发明采用的技术方案是：

一种抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法，所述方法为：将含0.1～1mmol/L DTT和0.1～2.5mmol/L EDTA的pH5.0～9.0的0.1mol/L醋酸缓冲溶液在30～50℃下水浴5～10min，加入固定化木瓜蛋白酶，30～50℃水浴20～30min，抽滤，弃去滤液A即除去DTT，获得滤饼A即为活化的固定化木瓜蛋白酶，将活化的固定化木瓜蛋白酶于pH5.00.1mol/L醋酸缓冲液中，加入抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体，30～60℃水浴反应4～24h，反应液抽滤，滤饼B为固定化木瓜蛋白酶回收利用，滤液B即为含单克隆抗体片段的水解液，采用弱阴离子交换层析对含单克隆抗体片段的水解液进行分离纯化，获得所述抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段；所述固定化木瓜蛋白酶以氨化纸纤维为载体，以戊二醛为交联剂，以木瓜蛋白酶为底物，于含1mmol/L DTT和2mmol/L EDTA的pH5.0的0.1mol/L醋酸缓冲液中，室温下搅拌8～24h，抽滤，得滤饼C即为固定化木瓜蛋白酶；所述氨化纸纤维是纸纤维先经0.1～0.2mol/L的NaOH溶液处理2～3h，再用环氧氯丙烷于60～70℃活化0.5～1h，最后用对苯二胺于40～50℃氨化0.5h，用蒸馏水充分洗涤，真空干燥至恒重，获得氨化纸纤维；所述固定化木瓜蛋白酶质量用量以抗体体积计为0.1～0.2g/ml抗体，所述固定化木瓜蛋白酶载酶量为0.002g/g固定化酶，所述抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体利用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化获得。

所述固定化木瓜蛋白酶按如下方法制备：将氨化纸纤维分散于含1mmol/L DTT和2mmol/L EDTA的pH2.0～6.5的0.1mol/L醋酸缓冲溶液A中，加入木瓜蛋白酶和质量浓度25％的戊二醛水溶液，室温下搅拌8～24h，抽滤，滤饼C用与所述的醋酸缓冲溶液A相同的醋酸缓冲液B充分洗涤，过滤，滤饼即获得固定化木瓜蛋白酶；所述氨化纸纤维与木瓜蛋白酶的质量比为1∶0.006，所述25％戊二醛水溶液以氨化纸纤维质量计为0.317ml/g，所述醋酸缓冲溶液A的体积用量对本发明没有影响，能够使纸纤维充分分散即可，体积用量通常以氨化纸纤维的质量计为33～40ml/g，所述醋酸缓冲液B的体积用量通常能够充分洗涤即可。