[发明专利]一种富马酸生产方法

说明书

发明领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种富马酸的生产方法。

背景技术

富马酸又名延胡索酸，学名反丁烯二酸。外观为白色、无气味的结晶粉末，有水果酸味，其酸味约为柠檬酸的1.5倍，可燃，在空气中稳定。富马酸是一种含有双键的二元羧酸，作为重要的有机化工原料和精细化工产品，广泛应用于食品及饲料添加剂、材料(树脂、涂料及增塑剂等)、医药、化工等领域。同时富马酸还是一种重要的四碳平台化合物，可以通过氨化、水合、加氢及异构等工艺生产L-天冬氨酸、琥珀酸、1，4-丁二醇、马来酸等四碳化合物，因此被美国能源部列为优先发展的12种平台化合物之一。

当前工业上主要采用顺酐(又称马来酸酐)异构法生产富马酸，其他可以用来生产富马酸的工艺还包括：糠醛氧化法、马来酸酶催化异构法、石蜡发酵法(又称假丝酵母发酵法)以及生物质原料发酵法等。富马酸的生产方法中顺酐异构法、马来酸酶催化异构法及石蜡发酵法采用的原料均为石油基产品，随着石油的枯竭及油价的大幅上涨，这些工艺不符合当前可持续发展的要求，且产品的市场竞争力越来越差。糠醛氧化法的原料虽说可以来自生物质原料，但该工艺的产品收率低、催化剂毒性大，不符合当前绿色环保的时代要求。生物法生产富马酸可以极大缩减原材料成本，避免化学法合成富马酸所带来的环境污染问题；通过代谢调控、基因改造、酶工程等手段是提高生物法生产富马酸的产率重要思路。正是由于这些原因，使得以可再生生物质为原料发酵生产包括富马酸在内的各种平台化合物成为各国政府今后发展的重点方向之一。20世纪初期就开始了霉菌发酵产富马酸的研究工作，随着科学技术的进步，富马酸得率一度到了30％-40％。

富马酸的生物合成法具体包括酶催化转化法和微生物发酵法。20世纪90年代中期出现的酶催化转化法一般都是以马来酸为底物，在马来酸异构酶作用下制备富马酸，但原料马来酸供应不足，且价格昂贵。20世纪70年代石油危机的出现，使得人们加大了对微生物发酵法制备富马酸的研究力度，这一时期人们用来发酵制备富马酸的微生物有霉菌、酵母及细菌。其中根霉菌Rhizopus为重点研究的对象，具体包括米根霉Rhizopusoryzae、少根根霉Rhizopusarrhizus以及黑根霉Rhizopusnigricans等。在这一时期，我国科学家对微生物发酵法生产富马酸的研究工作也进行了一定的探索，其中山西微生物研究所的白照熙等筛选出了具有产富马酸能力的少根根霉，当振荡培养于含有12％葡萄糖的培养基时，富马酸产量为53.15g/L，得率为45％，同时产生了较多的副产物如苹果酸等，但发酵周期较长，需要11天左右(食品与发酵工业，1988)。美国Purdue大学的Tsao教授等利用米根霉发酵产富马酸，98g/L初始葡萄糖发酵48h，其富马酸产量为33g/L，得率为33.7％(Bioprocess Biosyst Eng，2002，25：179～181)。

目前全世界富马酸的生产能力为34万t/a，其中我国富马酸年产量达到5万t左右，供求基本处于持平状态。富马酸的主要消费领域为不饱和聚Ra树脂、纸浆料助剂、食品、医药等领域。我国富马酸的应用范围小，用途单一，随着其应用领域的不断拓展，尤其作为一种平台化合物从它出发可以合成很多四碳化合物，在石油资源日益枯竭的情况下，其应用前景将越来越广阔。因此，迫切需要一种廉价，高效生产富马酸的方法。

生物酶法具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少和精制操作容易的优点，是一种较为有效的廉价生产富马酸的方法。本申请通过克隆表达富马酸酶，以L-苹果酸为原料，酶促反应催化脱水的方法通过体外酶法来制备富马酸，提供了一种廉价，高效生产富马酸的方法，具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少和精制操作容易的优点。本发明还优化了反应和分离条件，进一步提高了转化率和产品纯度。

发明内容

本发明提供克隆、并在大肠杆菌中表达一个来自嗜热栖热菌(Thermus Thermophilus HB8)的富马酸酶，其特征在于高表达量、高酶活、有机溶剂耐受及高温稳定性。

本发明提供一种生物法生产富马酸的方法。

前述方法采用一种以L-苹果酸为原料，酶促反应催化脱水的方法来制备富马酸。

前述方法，其特征在于优化了反应和分离条件，提高了转化率和产品纯度。

前述方法，其特征在于优化反应pH值，反应体系，特别是一定比例的有机溶剂的加入极大提高了转化效率。

发明详述