[发明专利]一株生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程技术领域，主要涉及一株生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌及其构建方法以及应用。 

背景技术

我国是世界第一大猪肉生产国，猪的存栏量、出栏量、屠宰量、猪肉总产量均居世界首位，但是由病原菌引发的传染病每年给养猪生产造成巨大的损失，严重影响我国养猪业与畜牧业的经济增长及出口创汇。目前对传染病的控制主要采用疫苗接种和抗生素治疗，疫苗的使用并不总是有效，而抗生素在预防和治疗猪细菌性疾病中确实发挥了重要作用，但长期大量使用带来了许多危害，其中突出的是造成病原菌广泛而严重的耐药性和药物残留，耐药性使得疫苗和抗生素对疾病预防无效，且药物残留严重影响肉品质，甚至危害人类健康。因此寻找无毒副作用、无残留、能高效控制疾病传染的天然杀菌药物，已成为十分紧迫的任务。 

革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria，GNB)包括大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎杆菌等20余种病原菌，其共同特点之一是细胞壁外膜的主要成分是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或称内毒素(endotoxin)，是决定GNB细菌感染(如脓毒症和感染性休克)的主要致病因子，与其他许多疾病有着密切的关系，如Crohn病、溃疡性大肠炎、新生儿坏死性小肠结肠炎、急性胰腺炎、肝硬化、酒精性肝病、阻塞性黄疸、牙周疾病等)、呼吸系统(如囊胞性纤维化、哮喘等)、心血管系统(如冠状动脉硬化)、泌尿系统(如溶血性尿毒综合征、血透或腹膜透析并发症)等多个系统疾病。近年研究证明，内毒素结合蛋白(endotoxin binding protein，EBP)及其受体系统在机体识别和调控内毒素作用中起重要作用，内 毒素通过其增敏或抑制作用而发挥生物学效应，其中杀菌通透性增加蛋白(bact ericidal/permeability increasing protein，BPI)起到关键作用。 

杀菌蛋白对革兰阴性菌具有杀伤作用，在机体内被称为“超级抗生素”。它不仅具有杀菌和中和内毒素的双重抗感染活性，还具有抗真菌、促进补体活化、增强吞噬的调理功能、抑制血管生成和抗原虫等一系列生物学功能，很有希望成为一种新型抗菌蛋白药物。程玉磊(2006)和祁克宗等(2006)仅克隆了猪BPIN端基因约140bp，且没有对该片段的表达及功能进行研究。秦孝建等(1999)报道的BPI功能区合成肽对光滑型G具有杀菌活性，周红和肖光夏(1996)和周红等(2002)对猪源BPI(从猪PMNs分离猪BPI)体外生物活性进行研究，证实具有杀菌功能。到目前为止，国内外尚无重组猪杀菌蛋白功能研究的相关报道。 

发明内容

本发明的目的是构建一株生产重组猪杀菌蛋白基因工程菌，并提出其构建方法。 

本发明的另一目的是该生产重组猪杀菌蛋白基因工程菌的应用。 

本发明的技术方案：应用RT-PCR技术，克隆猪杀菌蛋白基因的开放阅读框5’端片段678bp，将其整合到大肠杆菌表达载体pET32a(+)上，转化Esherichia coli BL21(DE3)，得到重组子，构建重组子文库，经筛选，最终得到一株能稳定生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌。 

一种猪杀菌蛋白基因工程菌，其分类命名为大肠杆菌BL21(DE3)-pET32a(+)-pBPIN(Escherichia coli BL21(DE3)-pET32a(+)-pBPIN)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011252。 

CCTCC M 2011252基因工程菌的构建，从黔邵花猪肝脏组织中提取RNA，进行RT-PCR扩增，引物： 

Forward Primer：5′-GCAAGGATCCATGGCCAGGGGCGCTGAC-3′ 

Reverse Primer：5′-CCATCTCGAGTTATTTTTTTCACTTTGGCTGTCACTGGCAG-3